广佛手rdna its序列测定及特点的初步分析

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1、广佛手rDNAITS序列测定及特点的初步分析作者：高晓霞，陈晓颖，罗源生【关键词】佛手；,,香橼；,,rDNA,ITS序列　　摘要：目的分析广佛手及其近缘种香橼的rDNAITS序列及其规律。方法采用PCR直接测序技术测定广佛手和香橼rDNAITS序列并作序列变异分析。结果4个植物样品rDNAITS序列长度为644~672bp。其中5.8SrDNA长度为165bp，编码区较保守。广佛手和香橼的ITS1和ITS2序列平均遗传距离分别为0.0095和0.0142。结论rDNAITS序列可为鉴定佛手提供分子参照系统。　　关键词：佛手；香橼；rDNAITS序列　　Abstract:Objective

2、TheribosomalDNAinternaotranscribedspacers(ITS)and5.8SrDNAITSsequenceofCitrusmedicaL.var.sarcodactylis(Nootc).SedicaL.entplifiedbyPCRersofrDNAITSandsequenced.ResultsTheDNAsequenceofITSrangedfrom644bpto672bpandthe5.8SgeneofallofthesamplesatedaccordingtoKimuratetermodelsbetedicaL.var.sarcodactylis(No

3、ot.)SedicaL.,aybetheevidenceforthemolecularauthenticationofCitrusmedicaL.var.sarcodactylis(Noot.)SedicaL.var.sarcodactyis(Noot.)SedicaL.;rDNAinternaltranscribedspacerssequence　　DNA分子标记技术进入到中药材鉴定和品质评价等研究领域，提供了大量的潜在特征，在中药材近缘属间，属内以及种内居群间的差异性研究［1］中得到了广泛应用。作为18S～26SrDNA组成部分，rDNA中的内转录间隔区（internaltranscr

4、ibedspacer,ITS）序列是中度保守的重复序列，在被子植物较低的分类阶元上具长度保守性和核苷酸序列的高度变异性［2］，这使得这些间隔区的序列可以用rDNA基因的通用引物实现快速扩增、容易排序，而高度变异性可以提供丰富的变异位点和信息位点，在许多被子植物发育和进化研究中已证明是十分有用的分子标记［3～5］。佛手是芸香科柑橘属植物CitrusmedicaL.var.sarcodactylis(Noot.)SedicaL.［8］也混作佛手使用，其品质呈现较大差异。为充分利用佛手这一地道药材资源，更好地控制其质量，本文测定了广佛手及其近缘种香橼的rDNAITS序列。通过探讨上述品种间的DN

5、A序列变异关系及其规律，为佛手基原植物的准确鉴定提供分子依据。　　1材料和方法　　1.1材料来自广州市的新鲜植物材料由广州省中药研究所华南中药种质资源库提供；来自广东化州地区的新鲜植物材料由本文第三作者采集，并由广东药学院中药鉴定教研室鉴定。见表1。　　表1广佛手和香橼rDNAITS序列特征及在EMBL的注册登记号（略）　　1.2试剂CTAB（gene）,ExTagDNA聚合酶（Mg2+，15mmol/L）（TaKaRa），琼脂糖（Promega）,PCR产物纯化试剂盒（QIAGEN），10mMdNTP(Sangon)。　　1.3主要仪器台式高速离心机（Sigma），涡旋混合仪（IKAg2

6、+2.4μl,10μmmol/L正向引物和逆向引物各1μl，DMSO1μl，ExTaq(5U/μl)0.1μl，DNA模板（适宜浓度）2μl，灭菌三蒸水（3dH2O）10μl。PCR扩增条件为94℃变性4min，94℃1min，50℃2min，72℃2min，循环30次；70℃延伸10min，以3dH2O代替模板DNA作空白对照。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳进行分析。PCR产物经QIAquickPCR纯化试剂合纯化后，由英骏广州测序实验室（英骏生物技术有限公司）测序。为保证测序的准确性，PCR扩增获得的3个目的片断分别采用正向和反向测序，用MegAlign程序进行序列的拼接。　　1.6

7、序列分析所得序列用CLUSTALX（Version1.8）进行多重比对［11］，编辑和校正多重比对结果用BioEdit(Version5.0.9)［12］;ITS1和ITS2的位置参照其二级结构,EMBL和GenBank上的参考序列。采用PAUP4.0（版本4.0b8）程序［13］，使用Kimurateter（K2P）［14］模型构建序列距离矩阵，将序列鉴定结果与形态鉴定结果核对，确认后在EMBL登记注册，其注册登记号见