非洲猪瘟病毒等温扩增快速检测方法（报批稿.pdf

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1、ICS11.220B41DB21辽宁省地方标准DB21/XXXXX—XXXX非洲猪瘟病毒等温扩增快速检测方法Loop-mediatedIsothermalAmplification（LAMP）forRapidDetectionforAfricanSwineFeverVirus（报批稿）本稿完成日期：2020年2月XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施辽宁省市场监督管理局发布DB21/XXXXX—XXXX前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由辽宁省农业农村厅提出并归口管理

2、。本标准起草单位：辽宁省农业发展服务中心、中国科学院微生物研究所、洛阳莱普生信息科技有限公司、辽宁佰瑞生物科技有限公司。本标准主要起草人：杨作丰、周晨阳、李秀梅、王宏燕、杨利敏、董娜、刘文军、张皓淳、姚伟、刘洋、刘近、吴洪涛、任雪建、赵培、李蓉、章春燕、吕园园、陈腾。本标准发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反馈，我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。归口管理部门通讯地址：辽宁省农业农村厅（沈阳市和平区太原北街2号），联系电话：024-2344

3、7862；标准起草单位通讯地址：辽宁省动物及产品检疫中心（沈阳市沈河区万柳塘路105号甲），联系电话：024-24229579。IDBXX/XXXXX—XXXX非洲猪瘟病毒等温扩增快速检测方法1范围本标准规定了非洲猪瘟病毒等温扩增快速检测方法的技术要求。本标准适用于非洲猪瘟疫病的诊断、监测及流行病学调查，适用于猪血液、脾脏、淋巴结、肾脏等组织样品中非洲猪瘟病毒核酸的快速检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，

4、其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求3原理非洲猪瘟病毒是一种DNA病毒，该检测方法利用6条特异性引物和具有链置换能力的DNA聚合酶，在等温环境下1h内完成扩增，用于非洲猪瘟病毒的核酸检测。4仪器和器材4.1高速台式冷冻离心机（离心范围0～20000r/min）4.2冰箱：4℃±1℃冰箱，-20℃±1℃冰箱，-7℃±1℃冰箱4.3恒温LAMP扩增仪（型号：Gene-8C）4.4离心管：15ml离心管、1.5ml离心管和0.2mlPCR专用离心管4.5微量移液器：

5、1000μl，200μl，100μl，50μl，20μl，10μl，2μl5试剂和引物5.1样品处理剂5.2ASFV-R-Mix5.3Bstenzyme5.4D-I矿物油5.5阳性对照5.6阴性对照注：本技术规范中使用的试剂，除另有说明外，所有实验使用的试剂等级均为不含DNA或DNase的分析纯或生化试剂；所有试剂均用无菌的容器分装。1DBXX/XXXXX—XXXX6操作步骤6.1样品的采集、前处理、存放与运输6.1.1采样注意事项采集样品及样品前处理过程中应戴一次性手套，样本间不得交叉污染。6.1.2

6、采样工具15ml离心管和1.5ml离心管经121±1℃高压灭菌20min；剪刀、镊子经160℃干热灭菌2h，无菌管（真空采血管）。6.1.3组织病料的采集与前处理采集疑似非洲猪瘟病毒感染猪的肺脏、肝脏、肾脏、脾脏等组织样品，用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品约10g于组织匀浆器或研钵中充分匀浆或研磨，加入0.3ml～0.5ml组织悬液混匀，60℃，30min灭活后，将悬液转入无菌Eppendorf管中，4℃条件下5000r/min离心10min，编号备用。6.1.4全血及血清样本的采集与前处理使用含有抗凝血

7、剂（EDTA-紫色盖）的无菌管（真空采血管）从耳静脉或前腔静脉采集血液3ml～5ml，60℃，30min灭活后，可直接检测；若检测血清，可静置全血样本待血清析出后，直接吸取至无菌Eppendorf管中，60℃，30min灭活后，编号备用。6.1.5存放与运输采集或处理的样品在2～8℃条件下保存应不超过24h；若需长期保存，应放置-70℃冰箱，但应避免反复冻融（冻融不超过3次）。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，在8h之内运送到实验室检测。按照《兽医实验室生物安全技术管理规范》进行样品的生物安

8、全标识。6.2样品DNA的提取取10μl前处理过的样本加入无菌1.5ml离心管，加入10μl样品处理剂，混匀，94℃裂解2min，瞬时离心，上清即为扩增模板。6.3核酸扩增6.3.1吸取22μlASFV-R-Mix和1μlBstenzyme加入同一个PCR管，吸取2μl步骤6.2处理的核酸扩增模板加至PCR管，混匀，设置阴阳性对照；6.3.2吸取10μlD-I矿物油轻轻加至PCR管液面，切勿震荡混匀；6.3.3插入到恒温扩增仪反应槽中；6.