非洲猪瘟病毒核酸检测方法

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1、附件猪用生物制品及相关猪源原辅材料中非洲猪瘟病毒核酸检测方法1适用范围1.1猪用及采用猪源原辅材料制备的生物制品成品及半成品。1.2猪源毒种。1.3猪源细胞及相关制品生产用细胞。1.4其他猪源原辅材料（如组织、血清、胰酶衍生物等）。2取样和处理2.1疫苗2.1.1活疫苗取至少2瓶样品，按瓶签注明头份用适宜稀释液分别稀释成10头份/0.2ml，等量混合，取混合液进行核酸提取。2.1.2灭活疫苗取至少2瓶样品，等量混合后进行以下处理。2.1.2.1油佐剂灭活疫苗取36ml混合疫苗，加入正戊醇4.0ml，充分振荡混合1分钟，2～8℃冰箱静置不少于60分钟，直至油相和水相分离。取

2、水相进行核酸提取。2.1.2.2水性佐剂灭活疫苗2.1.2.2.1铝胶佐剂灭活疫苗取混合疫苗5.0ml，摇匀，加入0.25g解离剂CPG-odn（人工合成的寡聚核苷酸），放入摇床（200r/min）37℃解离1小时，5000r/min离心10分钟，取上清液进行核酸提取。2.1.2.2.2其他水性佐剂灭活疫苗直接取混合样品进行核酸提取。2.2其他生物制品和半成品冻干类制品，按活疫苗进行取样和处理；液体制品及半成品，取至少2份（瓶）样品，等量混合，取混合液进行核酸提取。2.3猪源毒种取至少2支毒种。冻干毒种，按冻干前体积复溶后等量混合，取混合液进行核酸提取；非冻干毒种，等量混

3、合后直接取混合液进行核酸提取。2.4猪源细胞除另有规定外，取至少2瓶细胞浓度不少于107.0个细胞/ml的细胞悬液进行核酸提取。2.5其他猪源原辅材料2.5.1猪组织每种组织，分别取样和处理。取不少于2.0g组织，研磨后用5倍体积灭菌PBS悬浮，70℃灭活30分钟，4℃下以2000～3000g离心10分钟，取上清液进行核酸提取。2.5.2猪血清每批血清取至少2个最小包装的样品，等量混合，取混合液进行核酸提取。2.5.3猪胰酶干粉状胰酶，取至少2份样品，根据使用情况分别配制成不低于2.5%浓度的溶液，等量混合，取混合液进行核酸提取；液体胰酶，取至少2个最小包装的样品，等量混

4、合，取混合液进行核酸提取。2.5.4其他猪源衍生物固体、液体或干粉状猪源衍生物，可分别按组织、血清或干粉状胰酶的方法进行取样和样品处理。3核酸提取3.1试剂和器材3.1.1试剂根据核酸提取方法确定，如氯仿、异丙醇、无水乙醇、0.1mol/l柠檬酸钠（含10%乙醇）、75%乙醇等。3.1.2仪器核酸含量测定仪；常温台式离心机；旋涡振荡器；水浴锅；微量移液器1套（最大量程分别为10µl、100µl、200µl、1000µl）。3.1.3耗材1.5ml带盖离心管、无菌吸头（0～10µl、0～200µl、100～1000µl）、一次性乳胶手套。3.2操作程序（TRIZOL法），也

5、可以选择其他等效核酸提取方法提取样品中的DNA。3.2.1取样品250µl，加入750µlTrizol，颠倒混匀，室温放置5分钟。3.2.2加入200µl氯仿，充分混匀，室温放置10分钟，4℃下以12000g离心15分钟。3.2.3弃去上清液，加入220µl无水乙醇，颠倒混合，15～30℃放置2～3分钟，2～8℃以2000g离心5分钟，沉淀物为DNA。3.2.4弃去上清液，加入含10%乙醇的0.1mol/l柠檬酸钠750µl洗涤DNA，15～30℃放置30分钟，2～8℃以2000g离心5分钟。重复一次。3.2.5加入75%乙醇1.2ml，重悬DNA沉淀，15～30℃放置2

6、0分钟，4℃2000g离心5分钟。可重复一次，充分洗涤DNA沉淀。3.2.6弃去上清液，敞开离心管管口，在空气中干燥5～10分钟，加入30～50μl的无核酸酶灭菌水溶解DNA，－20℃以下保存备用。3.3注意事项3.3.1核酸提取试剂具有腐蚀和强变性能力，应做好个人防护，佩戴手套、口罩和护目镜，防止液体飞溅到皮肤和眼睛。3.3.2后续的核酸检测敏感性很高，要防止样品之间相互污染，最好使用带滤芯的枪头，且每次吸取取液体时均需更换枪头。3.3.3为防止核苷酸降解，应避免核酸酶污染，使用的耗材均需无核酸酶。3.3.4做好剩余样品的无害化处理及操作台面的消毒处理。剩余样品可通过高

7、压灭菌或煮沸处理，也可放在1%卫可或2%氢氧化钠消毒液中浸泡处理，操作台面使用1%卫可擦拭。3.3.5提取后的DNA样品要用锡箔纸封存，取样时应用枪头直接刺破锡箔纸取样，防止污染。4检测下列两种方法可任选其一。4.1实时荧光定量PCR检测法4.1.1试剂和器材4.1.1.1试剂4.1.1.1.1荧光定量PCR试剂本操作中以AppliedBiosystemsTaqManGeneExpressionAssayskit为例，也可选用其他荧光定量PCR试剂。4.1.1.1.2扩增引物及探针扩增引物：ASF-05-Zsak-1466F（