DB43_T 1670-2019非洲猪瘟病毒检测 免核酸提取荧光PCR法.pdf

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1、ICS65.020.30B41DB43湖南省地方标准DB43/T1670—2019非洲猪瘟病毒检测免核酸提取荧光PCR法DetectionofAfricanSwineFeverVirusReal-timePCRwithoutDNAExtractionMethod2019-10-15发布2019-12-15实施湖南省市场监督管理局发布DB43/T1670—2019目次前言………………………………………………………………………………………………………Ⅱ1范围……………………………………………………………………………………………………12规范性

2、引用文件………………………………………………………………………………………13术语和定义……………………………………………………………………………………………14主要仪器设备…………………………………………………………………………………………15主要耗材………………………………………………………………………………………………16试剂……………………………………………………………………………………………………27样品处理………………………………………………………………………………………………28样品检测…………………………………………………

3、……………………………………………39结果判定………………………………………………………………………………………………310生物安全要求………………………………………………………………………………………3附录A（规范性附录）试剂的配制…………………………………………………………………4IDB43/T1670—2019前言本标准按GB/T1.1—2009给出的规则起草。请注意本标准的某些内容可能涉及专利，本标准发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由湖南省畜牧水产局提出，由湖南省农业农村厅归口。本标准起草单位：湖南省动物疫病预防控制中心、

4、湖南国测生物科技有限公司。本标准主要起草人：何世成、王昌建、刘道新、喻正军、石建、范叶、林源、唐小明、黄建龙。IIDB43/T1670—2019非洲猪瘟病毒检测免核酸提取荧光PCR法1范围本标准规定了免核酸提取检测非洲猪瘟病毒核酸的荧光PCR方法。本标准适用于我省范围内开展非洲猪瘟病毒核酸快速检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求NY/T541兽医诊断样品采集、保

5、存与运输技术规范NY/T1948兽医实验室生物安全要求通则3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1非洲猪瘟（AfricanSwinefever，ASF）由非洲猪瘟病毒（AfricanSwinefevervirus，ASFV）引起的猪的一种急性、热性、高度接触性传染病，其发病率和病死率均可达到100%，是世界动物卫生组织（OIE）的法定报告传染病，在我国属于一类动物疫病。3.2荧光PCR实时荧光聚合酶链式反应（Real-timepolymerasechainreaction）。4主要仪器设备荧光PCR仪；台式离心机（转速≥12000r

6、/m）；小型离心机（转速≥6000r/m）；-20℃冰箱；微量移液器[（0.2～2.5）μL、（1～10）μL、（10～100）μL、（20～200）μL、（100～1000）μL等规格]；组织匀浆仪；高压灭菌锅；分析天平（精度0.01g）；生物安全柜。5主要耗材无DNase/RNase1.5mL离心管；与荧光PCR仪匹配的PCR薄壁管或8联排管；与移液器配套的各规格吸头。1DB43/T1670—20196试剂6.1引物与探针引物和探针的设计基于ASFVvp72基因序列，序列如下：a)上游引物：5’-GATGATGATTACCTTYGCY

7、TTG-3’，使用浓度为20μmol/L。b)下游引物：5’-CAACTAATATAAAAYTCTCTTGCTCT-3’，使用浓度为20μmol/L。c)探针：5’-FAM-CCACGGGAGGAATAYCAAC-Mgb-3’，使用浓度为10μmol/L。6.2核酸释放剂核酸释放剂配制方法见附录A.1。6.3荧光PCR试剂6.3.1TaqDNA聚合酶，浓度为5U/μL。6.3.2尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG酶），浓度为2U/μL。6.3.3dNTPs：由等量dATP、dUTP、dGTP、dCTP组成，终浓度为25mmol/L。6.3.42

8、×PCR缓冲液：配制方法见附录A.2。6.4阴性与阳性对照6.4.1阳性对照：灭活的非洲猪瘟病毒阳性样品，Ct值≤30，-20℃保存备用。6.4.2阴性对照：非洲猪瘟病毒核酸阴性样品，-20℃