SNT0762-2011-猪瘟病毒荧光RT-PCR检测方法.pdf

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1、版权所有·禁止翻制、电子发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜０７６２—２０１１猪瘟病毒荧光犚犜犘犆犚检测方法犘狉狅狋狅犮狅犾狅犳狉犲犪犾狋犻犿犲犚犜犘犆犚犳狅狉犱犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犮犾犪狊狊犻犮犪犾狊狑犻狀犲犳犲狏犲狉狏犻狉狌狊２０１１０５２０发布２０１１１２０１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局版权所有·禁止翻制、电子发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准猪瘟病毒荧光犚犜犘犆犚检测方法ＳＮ／Ｔ０７６２—２０１１中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：

2、６８５２３９４６６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６印张０．７５字数１７千字２０１１年１１月第一版２０１１年１１月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２２５９３定价１６．００元标准分享网www.bzfxw.com免费下载版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜０７６２—２０１１前言本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、上海市复星医学科技发展有限公司。本标准主要起草人：李春阳、刘俊平、熊炜、单松华、黄忠荣

3、、夏懿、胡永强、李树清、王巧全。Ⅰ标准分享网www.bzfxw.com免费下载版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜０７６２—２０１１猪瘟病毒荧光犚犜犘犆犚检测方法１范围本标准规定了猪瘟病毒荧光ＲＴＰＣＲ检测的操作方法。本标准适用于猪及其产品中猪瘟病毒的检测。２规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２分析实验室用水规格和试验方法３缩略语下列缩略语适用于本文件。荧光ＲＴＰＣＲ：荧光反转录聚合酶链式反应Ｃｔ值：每个反

4、应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数ＲＮＡ：核糖核酸ＤＥＰＣ：焦碳酸乙二酯犜犪狇酶：犜犪狇ＤＮＡ聚合酶４原理猪瘟病毒是有囊膜的正链ＲＮＡ病毒。根据猪瘟病毒不同分离株基因的保守序列，设计一对特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针。探针与病毒基因的保守序列结合，其结合部位位于引物扩增区域内。探针的５’端标记ＦＡＭ荧光素，它发出的荧光能够被检测仪器接收，称为报告荧光基团（用Ｒ表示），３’端标记ＴＡＭＲＡ荧光素，它在近距离内能吸收５’端报告荧光基团发出的荧光信号，称为淬灭荧光基团（用Ｑ表示）。ＰＣＲ反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探

5、针上Ｒ基团发出的荧光信号被Ｑ基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；ＰＣＲ反应进行到延伸阶段时，犜犪狇酶发挥其５’→３’外切核酸酶的功能将探针酶切水解，与此同时标记在探针上的Ｒ基团游离出来，Ｒ所发出的荧光不再为Ｑ所吸收而被检测仪所接收。随着ＰＣＲ反应的进行，ＰＣＲ产物与荧光信号的增长呈对应关系。５设备、材料和试剂５．１设备、材料５．１．１荧光ＰＣＲ检测仪。５．１．２高速台式冷冻离心机（离心速度１２０００犵以上）。５．１．３普通台式离心机（离心速度３０００犵）。１标准分享网www.bzfxw.com免费下载版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜０７６２—２０１１５．１．４

6、匀浆器。５．１．５冰箱（２℃～８℃，－２０℃，－７０℃三种）。５．１．６微量可调移液器（０μＬ～２μＬ，１μＬ～１０μＬ，１０μＬ～１００μＬ，２０μＬ～２００μＬ，１００μＬ～１０００μＬ）及配套带滤芯无ＲＮＡ酶的吸头。５．１．７水浴锅（５６℃，７０℃）。５．１．８高压锅。５．１．９无ＲＮＡ酶的（离心）管（１．５ｍＬ，０．２ｍＬ）。５．２试剂除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，所有试剂均用无ＲＮＡ酶污染的容器（用ＤＥＰＣ水处理后高压灭菌）分装。试验用水应符合ＧＢ／Ｔ６６８２要求。５．２．１异丙醇。５．２．２犜犪狇ＤＮＡ酶。５．２．３ｄＮＴＰ：含ｄＡＴＰ、

7、ｄＵＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ各１０ｍｍｏｌ／Ｌ。５．２．４逆转录酶。５．２．５７５％乙醇：用新开启的无水乙醇和ＤＥＰＣ水配制，－２０℃预冷。１）：组成、功能及使用注意事项参见附录Ａ。５．２．６ＲＮＡ核酸提取试剂盒２）：组成、功能及使用注意事项参见附录Ｂ。５．２．７猪瘟病毒荧光ＲＴＰＣＲ检测试剂盒６样品的采集与前处理６．１总则采样过程中样本不得交叉污染，采样及样品前处理过程中应戴一次性手套。６．２采样工具及其要求６．２．１剪刀、镊子、滴管、离心管、匀浆器。６．２．２所有上述采样工具应经１２１℃±２℃，１５ｍｉｎ高压灭菌并烘干或经１６０℃干烤２ｈ以上。６．３样品采

8、集和处理６．３．１肌肉或