GBT27540-2011猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法.pdf

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1、ICS11.220B41a园中华人民共$-n国国家标准GB/T27540—2011猪瘟病毒实时荧光RT—PCR检测方法Methodofthereal-timeRT—PCRforthedetectionofclassicalswinefevervirus2011—11—21发布2012-03-01实施丰瞀徽紫瓣警攒瞥翼发布中国国家标准化管理委员会厦19标准分享网www.bzfxw.com免费下载刚置GB/T27540一201本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)

2、归口。本标准起草单位:中国兽医药品监察所。本标准主要起草人:王琴、王泰健、徐璐、范学政、刘俊、蒋春燕、赵启祖、宁宜宝、邹兴启。标准分享网www.bzfxw.com免费下载1范围猪瘟病毒实时荧光RT—PCR检测方法GB/T27540—2011本标准规定了猪瘟病毒(Classicalswine{evervirus,CSFV)实时荧光RT—PCR检测方法。本标准适用于猪瘟的诊断和监测,适用于猪活体及其脏器、血液、排泄物和细胞培养物中CSFV核酸的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的

3、引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。中华人民共和国农业部公告第302号兽医实验室生物安全技术管理规范3缩略语下列缩略语适用于本文件。CSFV:猪瘟病毒(Classicalswinefevervirus)Ct值:达到阈值的循环数(cyclethreshold)DEPC:焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate)HSTaq酶:热启动TaqDNA聚合酶(HSTaqDNApolymerase)RNA:核糖核酸(ribonucleicacid)荧光RT-PCR:荧光逆转录聚合酶链式反应(realtimefluorescentquantita

4、tivereversetranscriptionpolymerasechainreaction)4试剂和材料除另有说明,所用试剂均为分析纯;所有试剂均用无RNA酶的容器分装。4.1Trizol:RNA抽提试剂,外观为粉红色,分装至棕色瓶中,于4℃~8℃保存。4.2氯仿:4℃预冷。4.3异丙醇:4℃预冷。4.475%乙醇:用新开启的无水乙醇和DEPC水配制,一20℃预冷。4.5DEPC水:去离子水中加入0.1%DEPC,37℃作用1h,(121土2)℃,高压灭菌15min。4.6RNA酶抑制剂(30U/t-L)。4.710×PCRbuffer(10mmol/LpH

5、8.3Tris—HCI,50mmol/LKCI,1.5mmol/LMgCl2)。4.8dNTP(2.5mmol/L)。4.9用于RT—PCR反应的引物浓度为10pmol/L,探针浓度为5gmol/L,其序列如下:上游引物F:5一TACAGGACAGTCGTCAGTAGTTCGA一3标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB/T27540—2011下游引物R:5一CCGCTAGGGTTAAGGTGTGTCT-3探针P:5-FAM—CCCACCTCGAGATGCTATGTGGACGA—TAMRA一34.10反转录酶:SuperscriptII反转录酶(200U

6、/pL)。4.11DNA聚合酶:HSTaqDNA聚合酶(5u/“L)。4.12阴性对照:DEPC水。4.13强阳性对照:非感染体外转录RNA(4200pg/pL)。4.14弱阳性对照:非感染体外转录RNA(42pg/p-L)。5器材和设备5.1高速台式冷冻离心机:最大离心力120009以上。5.2冰箱。5.3荧光PcR检测仪。5.4组织匀浆器。5.5微量移液器和吸头。5.6离心管。6样品的采集6.1采样注意事项采样及样品前处理过程中应戴~次性手套,样本不得交叉污染。6.2采样工具扁桃体采样器:鼻捻子、开口器和采样枪。使用前均应用3%氢氧化钠溶液浸泡消毒5min~

7、10rnin经清水冲洗。灭菌牙签和0.5mL或1.5mL离心管经(121士2)℃,高压灭菌15rain;剪、镊经160℃干烤2h。6.3采样方法6.3.1活体样品固定活猪的上唇,用开口器打开El腔,用采样枪采取扁桃体样品,用灭菌牙签挑至0.5mL或1.5mL离心管并作标记,编号,送实验室。取待检样品,按1:5倍体积加入DEPC水,于研钵或组织匀浆器中充分研磨,30009离心1,5min,取上清液转入离心管中编号备用。6.3.2内脏样品采取病死猪各种脏器(淋巴结、胰脏、脾脏、回肠、肝脏和肾脏)装入一次性塑料袋或其他灭菌容器,编号,送实验室。取50rng~100mg

8、待检样品,按1:5倍体积

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