GBT27540-2011-猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法.pdf

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1、ICS11．220B41a园中华人民共$-n国国家标准GB／T27540—2011猪瘟病毒实时荧光RT—PCR检测方法Methodofthereal-timeRT—PCRforthedetectionofclassicalswinefevervirus2011—11—21发布2012-03-01实施丰瞀徽紫瓣警攒瞥翼发布中国国家标准化管理委员会厦19标准分享网www.bzfxw.com免费下载刚置GB／T27540一201本标准按照GB／T1．1—2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术

2、委员会(SAC／TC181)归口。本标准起草单位：中国兽医药品监察所。本标准主要起草人：王琴、王泰健、徐璐、范学政、刘俊、蒋春燕、赵启祖、宁宜宝、邹兴启。标准分享网www.bzfxw.com免费下载1范围猪瘟病毒实时荧光RT—PCR检测方法GB／T27540—2011本标准规定了猪瘟病毒(Classicalswine{evervirus，CSFV)实时荧光RT—PCR检测方法。本标准适用于猪瘟的诊断和监测，适用于猪活体及其脏器、血液、排泄物和细胞培养物中CSFV核酸的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日

3、期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。中华人民共和国农业部公告第302号兽医实验室生物安全技术管理规范3缩略语下列缩略语适用于本文件。CSFV：猪瘟病毒(Classicalswinefevervirus)Ct值：达到阈值的循环数(cyclethreshold)DEPC：焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate)HSTaq酶：热启动TaqDNA聚合酶(HSTaqDNApolymerase)RNA：核糖核酸(ribonucleicacid)荧光RT-PC

4、R：荧光逆转录聚合酶链式反应(realtimefluorescentquantitativereversetranscriptionpolymerasechainreaction)4试剂和材料除另有说明，所用试剂均为分析纯；所有试剂均用无RNA酶的容器分装。4．1Trizol：RNA抽提试剂，外观为粉红色，分装至棕色瓶中，于4℃～8℃保存。4．2氯仿：4℃预冷。4．3异丙醇：4℃预冷。4．475％乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，一20℃预冷。4．5DEPC水：去离子水中加入0．1％DEPC，37℃作用1h，(121土2)℃，

5、高压灭菌15min。4．6RNA酶抑制剂(30U／t-L)。4．710×PCRbuffer(10mmol／LpH8．3Tris—HCI，50mmol／LKCI，1．5mmol／LMgCl2)。4．8dNTP(2．5mmol／L)。4．9用于RT—PCR反应的引物浓度为10pmol／L，探针浓度为5gmol／L，其序列如下：上游引物F：5一TACAGGACAGTCGTCAGTAGTTCGA一3标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27540—2011下游引物R：5一CCGCTAGGGTTAAGGTGTGTCT-3探针P：5

6、-FAM—CCCACCTCGAGATGCTATGTGGACGA—TAMRA一34．10反转录酶：SuperscriptII反转录酶(200U／pL)。4．11DNA聚合酶：HSTaqDNA聚合酶(5u／“L)。4．12阴性对照：DEPC水。4．13强阳性对照：非感染体外转录RNA(4200pg／pL)。4．14弱阳性对照：非感染体外转录RNA(42pg／p-L)。5器材和设备5．1高速台式冷冻离心机：最大离心力120009以上。5．2冰箱。5．3荧光PcR检测仪。5．4组织匀浆器。5．5微量移液器和吸头。5．6离心管。6样品的采集6．

7、1采样注意事项采样及样品前处理过程中应戴～次性手套，样本不得交叉污染。6．2采样工具扁桃体采样器：鼻捻子、开口器和采样枪。使用前均应用3％氢氧化钠溶液浸泡消毒5min～10rnin经清水冲洗。灭菌牙签和0．5mL或1．5mL离心管经(121士2)℃，高压灭菌15rain；剪、镊经160℃干烤2h。6．3采样方法6．3．1活体样品固定活猪的上唇，用开口器打开El腔，用采样枪采取扁桃体样品，用灭菌牙签挑至0．5mL或1．5mL离心管并作标记，编号，送实验室。取待检样品，按1：5倍体积加入DEPC水，于研钵或组织匀浆器中充分研磨，30009

8、离心1,5min，取上清液转入离心管中编号备用。6．3．2内脏样品采取病死猪各种脏器(淋巴结、胰脏、脾脏、回肠、肝脏和肾脏)装入一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号，送实验室。取50rng～100mg待检样品，按1：5倍体积