七厘散含药血清对乳鼠毛囊成纤维细胞增殖的影响-论文.pdf

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1、陕西中医2014年第35卷第3期375·实验研究·七厘散含药血清对乳鼠毛囊成纤维细胞增殖的影响刘爱军陈杏晔△广J,i、】中医药大学组胚教研室(广州510006)摘要目的：七厘散是促进皮肤愈合的经典方药，本文旨在探讨七厘散含药血清对SD乳鼠触须部毛囊真皮成纤维细胞增殖的影响。方法：无菌条件下分离SD乳鼠触须部完整毛囊，植块法培养真皮细胞，并利用免疫荧光技术进行鉴定。SD大鼠行七厘散灌胃，分别于灌胃后3d、5d、7d行腹主动脉取血，制备含药血清，用不同体积百分比的含药血清检测其对毛囊真皮细胞增殖的影

2、响。结果：分离培养的毛囊真皮细胞呈成纤维状，免疫荧光鉴定为成纤维细胞。3d和5d七厘散含药血清对毛囊真皮成纤维细胞的促增殖作用较7d组强。3d组中以体积百分比为5的含药血清组促增殖作用最强。结论：3d组体积百分比5A0的七厘散含药血清对SD乳鼠触须部毛囊真皮成纤维细胞有较强的促增殖作用，本实验为进一步探讨中药促毛囊真皮成纤维细胞增殖的分子机制提供实验基础。主题词七厘散动物，实验大鼠乳鼠【中图分类号1R96【文献标识码】Adoi：10．3969／j．issn．10007369．2014．03．07

3、4皮肤覆盖在人体表面，在日常生活中极易受到损伤，毛囊1．3．1SD乳鼠毛囊真皮细胞的获取将出生3d的同一真皮的成纤维细胞(fibroblast)能分泌I型胶原、Ⅲ型胶原、胎次的、正常发育的SD乳鼠1O只浸泡于75酒精中，5min×FN(fibronectin)等ECM成分和碱性成纤维细胞生长因子3次。剪去带有完整触须部毛囊的皮肤，双抗D-Hank’s液洗1(basefibroblastgrowthfactor，bFGF)、血管内皮细胞生长因子次，无双抗D-Hank’s液洗2次。超净工作台内分离出

4、完整的(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)等多种细胞因子，触须毛囊，均匀置于T25培养瓶，添加少量1OFBS的HG—能促进各种生长因子的分泌，诱导皮肤表皮细胞的增殖和迁DMEM培养基，37℃、5COz、饱和湿度条件下常规培养，24h移，促进皮肤创面的完整修复。七厘散是著名的伤科常用中成后添加培养基，细胞长满后按1：3进行传代。药，本项目组前期研究证明七厘散能促进创面成纤维细胞分泌1．3．2细胞爬片的制作将P2代细胞消化稀释成细胞胶原纤维，促进新生毛细新生，

5、修复表皮和毛囊，但中药促进皮悬液，按1×10／L接种于放有消毒盖玻片的24孔培养板中，肤愈合的作用机理并不清楚。本文通过探讨七厘散含药血清每孔接种1mL，于37℃、5CO、饱和湿度条件下常规培养，待对分离培养的SD乳鼠触须部毛囊真皮根鞘细胞增殖的影响，细胞长满盖玻片50左右时，取出盖玻片，0．01mmol／LPBS为更加深入的研究中药促进细胞增殖和分化的分子机制；寻找洗3次，中性甲醛固定30min，0．01mmol／LPBS洗3次。切实、有效的药物作用靶点奠定实验基础。1．3．3免疫荧光显微镜检

6、测P3代毛囊真皮细胞爬片，1材料与方法免疫荧光检测LN、FN、Vimentin的表达(实验步骤按产品说明1．1实验动物出生3d的SD乳鼠(雌雄不拘)，用于取书进行)，I抗效价均为1：100，Ⅱ抗效价1：100，sABC—Cy3触须部毛囊。雄性SD大鼠(质量180200g)，用于制备含药血显色后，DAPI复染细胞核，荧光显微镜观察拍照。清。以上实验动物均由广州中医药大学实验动物中心提供。1．3．4七厘散含药血清的制备七厘散灌胃液按0．15g／1．2主要试剂与仪器HG—DMEM培养(美国Gibco公

7、1．5mL配制，每天每只大鼠灌胃两次，间隔12h，灌胃量1．司)；优质胎牛血清(FBS)(天津灏洋生物制品科技有限责任公5mL／200g，连续灌胃，分别在3d、5d、7d腹主动脉血，每个时间司)；青霉素／链霉素(Hyclone公司)；0．01mmol／IPBS(Hy～点共灌胃5只大鼠，取血当日早晨再灌胃1次，间隔1h，麻醉大clone公司)；0．25胰蛋白酶(美国Sigma公司)；倒置相差显鼠，打开腹腔，负压管抽腹主动脉血。静置30min，3000r／min微镜(日本Olympus)；RT210

8、0C酶标仪(深圳雷杜生命科学股离心10min，吸取上层血清，将所得同一时间点的5只大鼠的血份有限公司)；I抗：层黏连蛋白(Laminin，LN)、纤黏连蛋白清混合，5O℃灭活30min，0．2m滤膜过滤除菌，分装，一20℃保(Fibronectin，FN)、波形蛋白(Vimentin)(均购自武汉博士德试存备用。剂公司)；Ⅱ抗IgG、SABC-Cy3试剂盒(武汉博士德试剂公1．3．5MTT检测七厘散含药血清对P3代毛囊真皮细司)；核荧光标记物DAPI(美国Sigma公司)。中成药七厘散胞增殖的影