瑞舒伐他汀对乳鼠心脏成纤维细胞增殖和凋亡的影响

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1、瑞舒伐他汀对乳鼠心脏成纤维细胞增殖和凋亡的影响作者：王倩崔炜张海林李亚【摘要】　　目的研究瑞舒伐他汀(Ros)对SD乳鼠心脏成纤维细胞（CFs）增殖的抑制作用，探讨其诱导CFs凋亡的作用机制。方法采用新生SD大鼠CFs进行体外培养，单独给予10-5，10-6，10-7，10-8mol/LRos或与10-5mol/L焦磷酸法尼酯（FPP）联合进行干预，应用MTT比色、BrdU比色、瑞氏吉姆萨染色倒置生物显微镜、Hochest33258染色荧光显微镜、流式细胞分析技术等方法观察Ros对CFs增殖的抑制作用和其对CFs凋亡的诱导作用。结果Ros不仅可明显抑制新生SD

2、大鼠CFs增殖和DNA合成，且可诱导CFs凋亡。10-5mol/LFPP可部分逆转此作用。结论Ros为有效的抗心脏纤维化药物，不仅可明显抑制纤维化进程，还可逆转已出现的纤维化。【关键词】大鼠；成纤维细胞；细胞增殖；凋亡；瑞舒伐他汀；焦磷酸法尼酯　　他汀类药物因其安全可靠的降脂作用和心血管保护作用，在临床上广为应用。然而，目前他汀类药物的应用范围主要局限于高脂血症者及冠心病患者，对于心衰患者是否应用及其利弊一直存在着争议。本文主要观察新型降脂药瑞舒伐他汀（Ros）对SD乳鼠心脏成纤维细胞（CFs）的增殖抑制作用，和对CFs凋亡的诱导作用，为他汀类药物在心衰患者应用

3、的可行性提供参考。　　1材料与方法　　1.1主要仪器及试剂　　CO2培养箱（HealForce）；生物安全柜（HealForce）；倒置生物显微镜（Olympus1×71）；相机（CanonDS126181）；倒置荧光显微镜（NikonEllipseTE2000S）；酶标仪（Fluostar）；离心机（AnkeTDL802C）；恒温振荡器（富华SHZ82）；Ros（石药集团中奇制药技术有限公司，批号：20081201，规格：原料药）；焦磷酸法尼酯（FPP）（瑞士Enzolifesciences公司）；DMEMF12培养基（美国Gibco公司）；胎牛血清

4、（奥地利PAA）；胰蛋白酶（美国Gibco公司）；噻唑蓝（MTT）（美国Biosharp公司）；二甲基亚砜（DMSO）（美国Amersco公司）；溴脱氧核苷尿嘧啶（BrdU）试剂盒（德国Roche公司）；瑞氏吉姆萨染液（珠海贝索生物技术有限公司）；细胞凋亡检测试剂盒（Hochest33258，美国Biosharp公司）。　　1.2实验动物及CFs的培养和鉴定　　取2～3天龄的SD大鼠（河北医科大学实验动物中心提供,许可证号：1001007）。无菌开胸，剪取心室，用DHanks液清洗，剪碎。0.125%胰蛋白酶+0.01%乙二胺四乙酸（EDTA）消化液反复消化

5、，分别收集各次消化细胞悬液，加入10%胎牛血清的DMEMF12培养基，离心，弃上清液。再加10%胎牛血清的DMEMF12培养基，制成细胞悬液，置37℃、5%CO2培养箱内培养。根据CFs比心肌细胞贴壁速度快的特点，差速贴壁60min，倾去上层未贴壁细胞，剩余的即为CFs，加入10%胎牛血清的DMEMF12培养液继续培养。经倒置显微镜观察，免疫组化波形蛋白单克隆抗体阳性，鉴定为所需要的CFs，细胞纯度达98%。待CFs生长接近融合时以1∶2传代，实验用2～4代细胞。　　1.3实验分组　　实验共分9组，空白对照组；10-5mol/LRos组；10-6mol/L

6、Ros组；10-7mol/LRos组；10-8mol/LRos组；10-5mol/LRos+10-5mol/LFPP组；10-6mol/LRos+10-5mol/LFPP组；10-7mol/LRos+10-5mol/LFPP组；10-8mol/LRos+10-5mol/LFPP组。　　1.4MTT法测定细胞增殖　　取对数生长期CFs5×107/L接种于96孔板中，37℃、5%CO2及饱和湿度下培养24h后，吸弃各孔培养基，分别加不同浓度的药物，继续培养24h，每组设8个复孔。各组于药物刺激结束前4h，每孔加入5mg/mlMTT10μl，37℃继续培养4h后终止培

7、养，吸弃上清液，每孔加入150μlDMSO，振荡混匀，在酶标仪上选取490nm波长测定吸光度值（A490值）。　　1.5BrdU法测定细胞DNA合成　　取对数生长期CFs5×107/L接种于96孔板中，37℃、5%CO2及饱和湿度下培养24h后，吸弃各孔培养基，分别加不同浓度的药物，继续培养24h，每组设8个复孔。严格按照Brdu试剂盒说明进行操作。各组于药物刺激结束前8h，每孔加入BrdU标记液10μl，37℃继续培养8h后终止培养，吸弃上清液，每孔加入固定液200μl，室温孵育30min，彻底去除固定液，每孔加入抗BrdUPOD工作液100μl，室温孵育

8、90min，弃去抗Br