转TLR4基因的绵羊胎儿成纤维细胞系的建立-论文.pdf

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1、中国摩掌通握2013，29(35)：63-68ChineseAgriculturalScienceBulletin转TLR4基因的绵羊胎儿成纤维细胞系的建立曹玉桃，李方舟，张全仓，顾美超，倪和民，刘云海，郭勇(北京农学院动物科学技术学院，北京102206)摘要：为了通过脂质体介导的方法获得高效表达目的基因TLR4的绵羊胎儿成纤维细胞作为供体细胞，以便在胚胎移植前的体外筛选过程中确定优越的转基因供体细胞，从而提高体细胞核移植生产抗病转基因绵羊的效率。本研究通过优化脂质体与质粒载体的比例浓度，进而再去转染原

2、代培养的绵羊胎儿成纤维细胞，经G418筛选，以EGFP(EnhancedGreenFluorescentProtein)作为报告基因，从形态学与分子水平鉴定出已经稳定表达目的基因：T0l1样受体4(TollLikeReceptor4，TLR4)基因的细胞系。最终经过筛选与纯化得到3个表达目的基因TLR4的细胞克隆，经RT-PCR与相对荧光定量PCR分析，在第二代转染的细胞中TLR4的表达最高，相对于未转染的绵羊胎儿成纤维细胞升高了9．65倍(0．01)，并藉此为最终制备抗病转基因羊新品种，从提供稳定表达

3、TLR4基因的转基因供体细胞系角度奠定基础。关键词：绵羊；n；胎儿成纤维细胞系；转基因克隆中图分类号：S8l3_3文献标志码：A论文编号：2013—1116TheEstablishmentofFetalSheepFibroblastsCellLineTransfectedwithVectorContainingTLR4GeneCaoYutao，LiFangzhou，ZhangQuancang，GuMeichao，NiHemin，LiuYunhai，GuoYong(CollegeofAnimalScien

4、ceandTechnology,BengUniversityofAgricuhure，Beijing102206)Abstract：InordertousetheLiposome——mediatedmethodtoobtainhigh——levelexpressionofTLR4genesheepfetalfibroblastcellsascompetentdonorcells．whichwasflexibleforthe一vitroscreenprogresstomakesuretheeffectiv

5、edonorcellsbeforeembryotransplantation．Thepreparationofcompetentdonorcellwascriticalfortheproductioneficiencyoftransgenicsheepbysomaticcellnucleartransfer(SCNT)．Inthisexperiment，theovinefetalfibroblastwastransfectedbylipofectionwiththereconstructedvector

6、containingthetargetTLR4,fleoandenhancedgreenfluorescentprotein(EGFP，reportgene)genes．Then，theywereselectedbyG418anddetectedbyEGFPpositively．Finally，thestabletransgenicovinefetalfibroblastcelllinebeingoverexpressedTLR4．wasestablishedbyidentificationfronbo

7、thmorphologicalandmolecularlevels．TheresuhsshowedthatusingtheoptimizingratioofliposomeandtheTLR4vectortogototransfectthefetalsheepfibroblast，thenselectedandpurified，wegot3differentpositivec]ones．Comparedthenon—transfectedfetalsheepcells，thecloneofhighest

8、expressionofTLR4wastransfectedinthepassage2，andanalyzedbyreversetranscriptionPCRandReal—timefluorescentquantitativePCR，itsTLR4levelincreased9．65times(P<0．01)．Collectively，thesestableexpresshighlevelTLR4donorcellswouldcontr