人cd14转基因细胞系的建立

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1、人CD14转基因细胞系的建立：宁铂涛，汤永民，徐妍，陈燕飞，曹江【摘要】本研究构建人CD14真核表达质粒，建立转基因CD14阳性细胞系，为建立急性单核细胞白血病（M5）导向治疗动物模型提供研究材料。从正常人外周血单个核细胞抽提总RNA，以无RNA酶的DNA酶处理，RT-PCR扩增CD14基因，T-A克隆测序并与GenBank中人CD14的基因序列比较核实。通过双酶切和体外连接法将目的基因克隆至表达载体pcDNA3.1(+)；用Superfecttransfectionreagent将重组质粒pcDNA3.1（＋）/CD14转染到C57BL/6小鼠黑色素瘤细胞B16，

2、经G418筛选，用流式细胞术检测CD14蛋白的表达情况，初步筛选出CD14阳性的细胞系B16/CD14。结果表明：测序及GenBank中序列比较结果显示扩增到的人CD14基因序列是正确的，酶切结果表明表达质粒构建正确。流式细胞术筛选到2个CD14阳性表达的细胞系B16/CD14（标准CD14-PE阳性细胞百分数分别为25.28％、36.59％，2F9-FITC为25.59%、36.32%）。结论：建立了人CD14抗原阳性表达的鼠细胞系B16/CD14，为人M5动物模型的建立及其导向治疗的研究奠定了坚实的基础。【关键词】转基因细胞系　　EstablishmentofM

3、urineCellLineTransfectedanCD14Gene　　AbstractThisstudyedtoconstructtheCD14eukaryoticexpressionvector，establishthetransgeneicCD14positivecelllineinordertofacilitatetheestablishmentofamousemodelofantibodytargetingtherapyforhumanacutemonocyticleukemia(AML-M5).TotalRNAextractedfromperiphera

4、lbloodmononuclearcellsanCD14geneurinemelanomacelllineB16anCD14onthetransfectantedbyfloetry(FCM).TheresultsindicatedthatthesequenceofthehumanCD14cDNAclonedeastheonefromGenBankdatabase.TherebinantpcDNA3.1(+)/CD14ecleaving.TheexpressionofthehumanCD14onthetransfectant(B16/CD14)edbyFCM.Inco

5、nclusion，themurinecelllineB16/CD14fransfectedanCD14genehasbeenestablishedanAML-M5antibodytargetingtherapyousemodel.　　Keyonocyticleukemia;mousemodel急性单核细胞白血病（AML-M5）是难治性白血病之一，CD14是M5细胞膜上的特异性标志，它在其它细胞成分包括T、B、自然杀伤细胞(NK)、红细胞、血小板、造血干/祖细胞以及非造血系统细胞上不表达［1］，并且单核细胞能通过CD14将与CD14抗原分子结合的分子内吞入细胞内［2］

6、，因此CD14是导向治疗AML-M5的良好靶点。本研究组已经将自制鼠源性抗人CD14单克隆抗体（ZCH-7-2F9）研制成基因工程抗体，拟进一步进行动物试验。为了建立良好的动物模型，一个稳定表达人CD14抗原分子的肿瘤细胞系是重要的环节。然而，除病人新鲜M5细胞外，国际上很少有CD14表达的单核细胞系存在，从而对该研究的深入进行带来困难。目前，大多数研究室仍然通过VitD3诱导单核细胞的细胞株U937来获得CD14阳性表达的细胞系［3］，这不仅不能保证CD14表达的均一性，也不利于人M5白血病动物模型的建立及其体内导向治疗的研究，通过转基因技术建立表达人CD14抗原

7、的鼠肿瘤细胞系是解决这一问题的可行途径。为此，我们利用C57BL/6小鼠黑色素瘤细胞B16的高效转染性，初步建立人CD14抗原阳性表达的鼠细胞系B16/CD14，为CD14阳性白血病动物模型的建立奠定了基础。　　材料和方法　　标本、主要试剂及仪器　　单核细胞来自正常人外周血，进口直标单克隆抗体CD14-PE、γ1-FITC、γ1-PE为美国BectonDickinson公司产品；2F9-FITC为本实验室研制的直标鼠抗人CD14单克隆抗体试剂；TrizoL液、高保真度TaqDNA聚合酶、Loega公司；QIAquickDNA纯化试剂盒购于Qiagen公司；RPM