转蜘蛛拖丝蛋白基因二聚体绵羊成纤维细胞株的筛选

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1、万方数据学校代码：10225学号：S13165学位论文转蜘蛛拖丝蛋白基因二聚体绵羊成纤维细胞株的筛选指导教师姓名：申请学位级别：论文提交日期：授予学位单位：王子竹安铁洙教授硕士2013年4月东北林业大学学科专业：发育生物学论文答辩日期：2013年6月授予学位日期：2013年6月答辩委员会主席：论文评阅人：聋夕厶栉案大学万方数据UniversityCode：10225RegisterCode：S13165llIIIIIIIIIIIIIHIIIbllllIIlY2721006DissertationfortheDegreeofMasterFiltrationofTransgenicSh

2、eepSkinFibroblasts。所jthPolymerizedSpiderCandidate：Supervisor：AcademicDegreeAppliedfor：Speciality：Dateof0ralExamination：University：DraglineSilkProteinGeneWangZizhuProf．AnTiezhuMasterDevelopmentalBiologyJune，2013NortheastForestry万方数据摘要蜘蛛丝是目前己知的一种集多种优良性能于一身的纤维，无论与其它天然材料还是人工合成的材料相比，蜘蛛丝都显示出了绝对的优势。但

3、是由于蜘蛛的生活习性以及织网特点，无法通过人工进行大规模饲养繁殖，这些都给蜘蛛丝的大量获取造成了巨大困难。本研究通过绵羊可以产生由角蛋白构成的羊毛为启迪，利用本实验室前期合成的蜘蛛丝蛋白基因二聚体和绵羊毛发角蛋白启动子B2C，将B2C与报告基因相连，验证其是否具有表达活性，并将绵羊毛发角蛋白启动子与pcDNA3。1相连构建真核表达载体，再与蜘蛛丝蛋白基因二聚体相连后转染绵羊皮肤成纤维细胞，经抗性筛选后扩大培养，建立转拟蜘蛛丝蛋白基因二聚体绵羊皮肤成纤维细胞系。为后续产生被毛中表达蜘蛛拖丝蛋白的转基因绵羊奠定了基础。实验的结果与结论如下：(1)绵羊毛发角蛋白启动子B2C的活性检测：将

4、绵羊毛发角蛋白启动子pEasy．T3一B2C与报告基因GFP相连，构建重组质粒B2C—GFP，将其转染绵羊皮肤成纤维细胞。结果在蓝光激发下观察到了绿色荧光，证明了该启动子在绵羊皮肤成纤维细胞中具有表达活性；(2)真核表达载体的构建：将去除自身CMV巨噬细胞病毒启动子的pcDNA3．1与经过相同酶切的启动子B2C相连接，再与蜘蛛拖丝蛋白基因二聚体2s相连接，成功构建了真和表达载体pcDNA3．1一B2C一2S；(3)转基因阳性细胞的筛选：通过脂质体转染法将线性化的pcDNA3．1一B2C一2S转染绵羊皮肤成纤维细胞，用最适终浓度的G418对转染后的细胞进行筛选，得到了生长状态良好的转

5、基因细胞；(4)转基因细胞的检测：提取转基因细胞的基因组DNA，通过PCR检测显示pcDNA3．1一B2C一2S整合到了绵羊皮肤成纤维细胞的基因组中，将转基因细胞进行冻存与复苏，复苏后的细胞生长状态依然良好。通过以上叙述可知，本研究获得了转蜘蛛拖丝蛋白基因二聚体绵羊皮肤成纤维细胞系。关键词蜘蛛拖丝蛋白；B2C启动子：表达载体；绵羊皮肤成纤维细胞；转基因细胞万方数据AbsU-actAbstractThespidersilkisknownasyettobethebestfiberwithmanyhighperformancesincomparisonwithothernaturalma

6、terialsorsyntheticmaterial．Howevertherewasagreatdifficultyingaininglargequantityofthespidersilk．Duetothebehaviorandthecharacteristicsofweavingweb，thespiderisunabletobeculturedonfllargescale．Thisresearchgainedagooddealofe11li曲tenmentfromtheresearchthatsheepcanproducethewoolconsistingofkeratin．I

7、nourpreviousstudies，spidersilkproteindimerandsheephairkeratinpromoterB2Chavebeensynthetized．Inthisresearch，reportergenewasconnected、)lrimB2C，andthentestitsbiologicalactivity．SheephairkeratinpromoterwasconnectedwithPcDNA3．1toconstructits