uhs-蜘蛛拖丝蛋白基因二聚体转染小鼠成纤维细胞的研究

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1、万方数据UniversityCode：10225RegisterCode：09045DissertationfortheDegreeofMasterResearchontransfectionofmousefibroblastsbyUHS—-spiderdraglinesilkproteindimmerCandidate：SuperviSOF"AcademicDegreeAppliedfor：Speciality：DateofOralExamination：University：LiuXinPr

2、of．AnTie．zhuMasterDevelopmentalBiologyJune，2009NortheastForestry万方数据摘要为了加速建立利用转基因技术的通过动物被毛获取蜘蛛丝蛋白的新方法，本研究以小鼠为模型，在利用常规法建立小鼠成纤维细胞系的基础上，依次通过小鼠皮肤特异性启动子的克隆、连接蜘蛛丝蛋白基因的表达载体的构建、转染小鼠成纤维细胞等程序，探讨了建立转蜘蛛蛋白基因二聚体阳性细胞的可能性。其结果：(1)采用常规方法，利用新鲜或冷藏保存96h以内的胎鼠皮肤经原代和传代培养后建立

3、了小鼠成纤维细胞系。(2)对GenBank中的蜘蛛拖丝蛋白基因序列人工合成的丝蛋白基因单体，利用不同的酶切位点进行了二聚化，通过用BglII、NcoI及BamHI、Nc01分别双酶切构建了蜘蛛拖丝蛋白基因二聚体的质粒；(3)成功克隆了在小鼠皮肤中特异表达的超高硫角蛋白(UHS)启动子。将其与pAcGFPl-N1载体以及p139al—Basic载体连接，分别构建了UHS—GFP和UHS一口一gal表达载体；所构建的UHS—GFP具有体外培养的小鼠成纤维细胞的活性，而UHS一目一gal．表达载体具有

4、在胎鼠皮肤块组织中的表达活性。(4)通过BgllI和BamHI双酶切得到小于5000bp和1000～2000bp的条带，PCR鉴定得到约700bp的UHS条带，以此验证成功构建UHS一2S一3．1表达载体。(5)对转染后的成纤维细胞进行G418抗性筛选扩增的阳性细胞，经对其基因组DNA的PCR鉴定，确认基因组整合有目的基因(蜘蛛丝蛋白基因二聚体)。上述结果为进一步开展转蜘蛛丝蛋白基因的阳性细胞筛选并建立细胞系，为通过体细胞核移植技术获得转基因小鼠及建立利用动物被毛获得蜘蛛丝的新方法奠定基础。关键

5、词小鼠成纤维细胞；超高硫角蛋白启动子；蜘蛛蛋白基因；基因转染万方数据AbstractInordertoacceleratetheestablishmentofanewmethodtoobtainthespiderdraglinesilkproteingenefromanimalhairbyusingtransgenietechnology,mousewaschoseasaanimalmodel．Mousefibroblastcelllinebasedonconventionalmethodswa

6、sestablished；ahairfolliclespecificpromoterofmousewasclonedandlinkedintothegeneexpressionvectorwhichcontainedspiderdraglinesilkproteingene．Thenmousefibroblastsweretrans—fectedwiththerecombinationplasmidinthehopeoffindingthepossibilityofobtainpositivec

7、ellsofspiderdraglinesilkproteingene．Resultsshowedasfollows：j(1)Bothfreshskinandtheskinfrozenwithin96hcouldbeusedtoestablishamousefibroblastcelllinebyconventionalmethods．(2)ThespiderdraglinesilkproteingenemonomerwassynthesizedaccordingtothesequenceinG

8、enBank，andthen，obtainedthedimmerbYincubatingrespectively．(3)Theultrahighsulfurkeratin(UHS)promoterwassuccessfullyclonedandlinkedintopAcGFPl-N1andp／39al—Basicvectorsrespectively；theUItS—GFPexpressedinmousefibroblastceilsinvitro，andtheUHS—pgalvectorexp