抗猪瘟病毒基因转染仔猪皮肤成纤维细胞研究

《抗猪瘟病毒基因转染仔猪皮肤成纤维细胞研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、万方数据StudyonTransfectingtheAnti—SwineFeverVirusGeneintothePigletSkinFibroblastsThesi：submittedt011eSlSsubmmetO@ngdaoAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeof—MasterofAgronomy1一一ZhangWenpingCollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedici

2、neSupervisor：SongXuexiongQingdao．ChmaJune，2013万方数据独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得青岛农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：掀受手时间：弘侈年彳月加日关于论文使用授权的说明本人完全了解青岛农业大学

3、有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意青岛农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：移次主手时间：砧年／月如日铷签名：铲移帆州年觚万方数据青岛农业大学硕士学位论文摘要抗猪瘟病毒基因转染仔猪皮肤成纤维细胞研究摘要本研究旨在构建抗猪瘟病毒转基因供核细胞，为培育抗猪瘟病毒转基因克隆猪奠定基础。本研究的内容和结果如下：1．

4、仔猪皮肤成纤维细胞的分离和培养本试验采集仔猪耳组织，用组织块培养法进行原代分离培养，然后采用不同,h"4e液的浓度(0．1％、0．125％、O．25％和0．5％)、不同消化温度(4"C、室温(25℃)和38．5℃)、不同细胞密度(5～6x103个／nil、2～3x104个／ml和5—6×104个／nil)和不同胎牛血清浓度(5％、8％和10％)，观察了这些因素对细胞培养的影响，并绘制了细胞生长动力学曲线。结果显示，采用0．1％消化液、室温消化、2～3×104个／ml细胞密度、用含8％胎牛血清的DMEM

5、培养液进行细胞传代培养效果最佳，细胞传代至20代以上仍保持良好状态，生长曲线为“S”型。这些结果表明，本试验优化的培养方法对仔猪成纤维细胞的传代培养效果良好。2．脂质体介导抗猪瘟病毒质粒转染仔猪成纤维细胞本试验用脂质体介导抗猪瘟病毒质粒DNA转染仔猪成纤维细胞，从脂质体用量(0．8、1．5、2、3和491)、质粒DNA用量(O．4、0．6、0．8、1．0和1．299)、脂质体．质粒混合时间(10、20、30、40、50和60min)、转染时间(1、2、3、4、5和6h)、质粒DNA的构型(环形、线性和

6、环线等量混合)和细胞汇合度(30％～40％、50％～60％、．70％～80％和90％～100％)等方面进行了转染条件的优化摸索。结果显示，在细胞汇合度70—80％时，用2p1脂质体介导O．899环形质粒DNA转染仔猪成纤维细胞2h，转染效果最好，转染率可达43．23％。这些结果表明，本试验优化的转染方法获得较高的转染效果。3．转染细胞的筛选及鉴定通过检测成纤维细胞对G418的敏感性，选择G418的最佳筛选浓度进行筛选，筛选后提取转染阳性细胞DNA，PCR扩增和电泳，检测目的基因整合情况。结果显示，0．

7、6mNmlG418浓度为最佳筛选浓度，可在一周内将细胞全部杀死，将0．2～0．4mNmlG418作为维持筛选浓度。转染24h后，加入含0．6mg／ml的筛选液筛选一周，更换O．2—0．4mg／mlG418筛选液继续筛选和扩增，4周后，获得80％以上的转染阳性细胞：阳性细胞的DNA通过PCR扩增和电泳检测后，获得601bp的目的基因条带。这些结果表明，万方数据青岛农业大学硕士学位论文摘要转染的细胞已整合抗猪瘟病毒基因。4．电穿孔法介导抗猪瘟病毒质粒DNA转染仔猪成纤维细胞本试验通过电穿孔法介导抗猪瘟病毒

8、质粒DNA导入仔猪成纤维细胞，从电压(150V、180V、20．0V、220V、240V和260V)、脉冲时间(15ms、20ms、25ms和30ms)、脉冲次数(1、2和3)、质粒DNA用量(81．tg、12岭、16pg、20p．g和24pg)、电击后温度r(4℃、25℃和38．5℃)、电击缓冲液(PBS、限定电转液、无血清DMEM和含10％FBSDMEM)、质粒DNA的构型(环形和线性)等方面进行了转染条件的优化摸索。转染的细胞用G418筛选和扩增，