mt1基因转染永生化内蒙古绒山羊皮肤成纤维细胞的研究

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1、摘要褪黑激素(Melatonin，Mel)通过与其高亲和性G蛋白偶联受体的结合来发挥调节季节性繁殖、毛发生长周期调控等生物学功能。褪黑激素在毛发周期调控过程中的作用机理研究的尚未清楚，为了研究褪黑激素在毛发周期调中基因调节功能，本研究利用脂质体法将褪黑激素膜受体1基因（MT1）导入永生化绒山羊皮肤成纤维细胞中，筛选得到稳定表达细胞株，为进一步研究褪黑激素调节毛发周期的基因调控模型和褪黑激素的作用机理奠定了基础。研究中将编码hTERT基因导入内蒙古绒山羊皮肤成纤维细胞，经过G418筛选得到阳性克隆，经扩大培养后不断传代得到永生化细胞系。RT-PCR检测目的基因在阳性克隆中稳定表达，生长

2、状态良好连续传代60代，并将其命名为永生化绒山羊皮肤成纤维细胞系(hTERT-GSFs)。表达载体ppEGFP-N1/MT1的构建，通过RT-PCR方法利用绒山羊下丘脑总RNA获得MT1基因编码区cDNA序列，并将MT1片段连接在真核表达载体pEGFP-N1的XholI+SalI位点，构建表达载体pEGFP-N1/MT1。分析表明本研究所构建的表达载体pEGFP-N1/MT1结构与序列均与预期设计相符合。用脂质体法将MT1基因导入永生化绒山羊皮肤成纤维细胞，经倒置显微镜检测，采用滤纸片消化法活得表达绿色荧光蛋白的转基因细胞，PCR技术检测MT1的表达，实验组表达MT1，而对照组细胞不

3、表达MT1，表明构建的载体具有正常的功能。通过对转基因细胞基因组DNA的PCR扩增，证实外源基因已稳定整合在转基因细胞基因组中，将表达MT1基因的阳性细胞命名为MT-hGSFs，转MT1基因的细胞成功获得为进一步研究褪黑激素的作用奠定基础。关键词:绒山羊；褪黑激素受体1；基因转染；成纤维细胞；StudyonMT1genetransfectedintoimmortalizedInnerMongoliacashmeregoatskinfibroblastcellsAbstractMelatoninisacriticalregulatorofneuroendocrinehormonesas

4、highaffinitythroughitsGprotein-coupledreceptorbindingtoperformtheirbiologicalfunctions.Melatoninonthebodyinmammalshasaverywiderangeofphysiologicalregulation,includingtheregulationofseasonalbreeding,hairgrowthcycleregulation,foodintake,obesity,bodytemperatureregulation,pigmentation,sleep,circadi

5、anrhythm,cellgrowth,immuneresponse,etc.Whilethemechanismofregulationhairgrowthwasunclear.Toclarifymelatonininthecellfunctionofgeneregulationduringdevelopment,thisstudyliposomeintotheeukaryoticexpressionvectorpEGFP-N1/MT1toimmortalizedgoatskinfibroblastcells,stablecelllineswerescreenedforfurther

6、studyofmelatoninregulatinghaircyclegeneregulationmodelandthemechanismofmelatoninbasis.LiposomegeneencodinghTERTtransfectionofeukaryoticexpressionvectorofInnerMongoliacashmeregoatskinfibroblastcellsafterG418G418resistantclonesscreenedbyexpandingculture.RT-PCR,geneexpressioninstableclones,positiv

7、eclonesinvitrocontinuousculture,growthingoodpassageof60generations,andnameimmortalizedgoatskinfibroblastcellline(hTERT-GSFs).Theexpressionofmelatoninmembranereceptor1(MT1)ofcashmeregoathypothalamusbyRT-PCR.MT1fragmentswillbeconnec