大腹园蛛拖丝蛋白基因的克隆和序列研究

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1、多重PCR、热启动PCR等方法进行扩增，并根据实验结果最终确定了长距离PcR反应对复杂基因的扩增。通过多种引物对实验、MgCI:浓度梯度实验、引物浓度梯度实验、退火温度梯度实验、延伸时间梯度实验、touchdown循环等实验对PCR以及RT-PCR反应条件进行优化，以扩增大腹园蛛拖丝蛋白基因。凝胶纯化、回收扩增获得的大腹园蛛拖丝蛋白基因DNA，克隆于pDrive载体，筛选转化子，并经PCR、酶切和序列分析鉴定阳性克隆。将其中的一个克隆基因片段构建入pET犯a(+)蛋白表达载体。本论文以DNA为模板，通过P

2、CR扩增获得了编码大腹园蛛拖丝蛋白基因的克隆AvDSI，序列长2199bp，序列分析表明不含基因内含子;通过Rf-PCR，获得了编码大腹园蛛拖丝蛋白基因的克隆AvRSZ，序列长951bp;序列比较分析推测大腹园蛛拖丝蛋白基因存在着两种组分，AvRsZ克隆为编码大腹园蛛拖丝蛋白基因组分一1，AvDsl克隆可能为大腹园蛛拖丝蛋白基因的另一组分一2。获得了可以表达大腹园蛛拖丝蛋白基因AvRsZ的pET-RsZ表达载体。这些成果有助于进一步研究大腹园蛛拖丝蛋白基因的基因组成和结构特征、为应用蛋白质剪接技术开发蜘蛛

3、拖丝蛋白的研究提供了基因克隆，构建的表达载体为进一步研究蜘蛛拖丝蛋白基因的表达、表达蛋白的结构以及应用表达蛋白进行人工纺丝奠定了基础。关键词:大腹园蛛，拖丝蛋白基因，克隆，表达载体CloningandSequeneeAnalysisofAraneusVentrieosusDraglineSilkPreteinGeneABSTRACTSPiderdraglinesilkwithuniqueeharacteristiesofhighstrengthandelastieitybeeomesagoodnatura

4、lProteinfibe几andwasnamedbiosteelinsPider’5sevendlfl笼rentfunctionalsilks.SPiderdraglinesilkProtein15comPosedofrePeatedsequenees，highGCandnumerousiterationsoffourdifferentaminoaeidmotifs.It15diffieultytodesignPrimersforPCRandR卫PCR，andalsoit15difficultytoobt

5、aineomPletgeneofsPiderdraglinesilkProteinbeeauseofthecomPetitionbetweentemPlatesandPrimers.AiPresent，therearenorePortsontheeomPletesPiderdraglinesilkgeneandthemolecularweight.ThegeneeloningandexPressionmakeProgressslowly.RenHonglingetaleonstruetedtheeDNAP

6、laguelibraryandonlygotabout1.7kbAxaneusventrieosusdraglinesilkProteingene.BeekwittetalonlyamPlified300bPand7O0bPdraglinesilkProteingenebyPCRfromAianeusBicentenariusgenomeDNA.ThisPaperehoseAraneusventrieosusasaresearchmaterial，andthegenomeDNAandtotalRNAwer

7、eeXtractedfromthesPeeialglandnamed力厂majoramPulate(MA)gland.ManyPrimersweredesignedandsynthesed.ThedraglinesilkProteingenewas田卫Plified饰normalPCR，multiPlePCRandhotstartPCRetal.PCRandRT一PCReonditionswereoPtimizedbyPrimersexPeriments，MgC12eoneentrationgradien

8、texPeriments，PrimereoneentratlongradienteXPeriments，annealingtemPeraturegredientexPeriments，extendingtemPeraturegradientexPeriments，touehdowneyeleeXPerimentsetal.Thedraglinesilk拼oteingeneswereelonedintopDriveveetora