资源描述：
《人参ago1基因克隆和序列研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、人参AG01基因克隆和序列研究［摘要］目的：从人参叶片中克隆Argonaute1(PgAGOl)的全长基因，并利用生物信息学方法进行分析。方法：根据人参EST序列设计特异性引物，采用RACE方法克隆PgAGOl的cDNA全长，并对PgAGO1蛋白的结构进行预测、氨基酸序列多重比对以及构建系统进化树等分析；同时采用实时定量PCR检测PgAGOl基因在人参不同组织根、茎、叶、花和愈伤中表达水平。结果：克隆的PgAGOl全长cDNA为3776bp,其中包括5’UTR204bp,3’UTR254bp,基因内部包含完整的开放阅读框，可编码1105个氨基酸，预测蛋白
2、质相对分子质量为122.22kDa,理论等电点pl9.71；实时定量PCR检测结果表明PgAGOl基因在人参花中的表达量最高，在根中最低。结论：从人参叶片中克隆得到PgAGOl的全长cDNA,为进一步研究该基因在人参组织发育中的调节作用打下基础。［关键词］人参；microRNA；Argonaute1；RACE；生物信息分析MicroRNA(miRNA)是真核细胞内一类大小为20〜24nt的内源性非编码单链小RNA,广泛分布于动植物体内，具有高度保守性［1-3］o在植物体内，miRNA通过调节靶基因来控制植物根、茎、叶、花等的形态建成、细胞分化、疏导组织形
3、成以及植物对生物和非生物胁迫的响应，在植物生长、发育和分化等过程中发挥非常重要的调控作用[2-6]o成熟的miRNA通过与RNA诱导的沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)结合，形成具有切割活性的RNA沉默复合物，再与靶基因互补配对来降解靶基因或抑制靶基因的翻译[4,6-7]oAGO蛋白作为RISC的核心，在小RNA沉默通路中发挥关键作用。拟南芥AtAGOl是目前研究最为透彻的、功能也最为重要的一个AGO蛋白[8-9],参与miRNA、转录后基因沉默(PTGS)、病毒诱导的基因沉默(VIGS)或抗病毒沉默和ta-s
4、iRNA等多个通路。目前，有关AGO蛋白家族的功能和作用机制还未完全清楚，研究主要集中在拟南芥和水稻等几种模式植物中，药用植物人参AGO基因的研究未见报道。本研究以人参叶片为材料，对PgAGOl进行克隆，得到其cDNA全长序列3776bp；采用荧光实时定量PCR检测PgAGOl基因在人参不同组织中的表达水平，为进一步研究该基因的作用机制奠定基础。1材料ETC811东胜PCR扩增仪,CFX96BI0-RAD荧光定量PCR仪，BIO-RAD凝胶成像系统等；大肠杆菌DH5a,TOP10及DNA快速凝胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司；总RNA提取及RACE试
5、剂盒为Invitrogen产品；Poly(T)AdaptorRT-PCR试剂盒为Ambion产品；DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒、pMD18-TVector,TaqDNA聚合酶、DNAMarker及实时定量PCR试剂盒购自大连宝生物工程公司；其他试剂为国产分析纯，实验中所用的引物合成以及序列测定由北京三博远志公司完成。2方法2.1人参叶片的取材本实验用于基因克隆的材料为石柱参PanaxginsengC.A.Meyercv.Shizhu,于2012年4月中旬购自辽宁省丹东市宽甸镇石柱子村参场。经中国医学科学院药用植物研究所人工气候室培育2周后对不同组织R
6、T(root根)，ST(stem茎)，LE(leaf叶)，FL(flower花)取材并迅速保存于液氮中。人参愈伤组织EC(embryogeniccallus胚性愈伤)的诱导与取样见[11]o2.2PgAGOl基因的全长克隆采用Trizol方法抽提人参叶片总RNA。总RNA的纯化及DNaseI消化参照RNeasyPlantMiniKit(Qiagen)o用Oligotex试剂盒纯化总RNA,获得mRNA；根据InvitrogenGeneRacer试剂盒对mRNA进行去磷酸化、去帽子结构、连接接头；用SuperScriptIII(Invitrogen)试剂盒
7、进行反转录，合成cDNA第一链。根据人参EST1(Genbank：gb
8、HS077398.1
9、)设计引物AGOR1,AG0R2,AG0F1；EST2(FW1NBNE01A7WLY)设计引物AG0R3,AG0F2；EST3(gb
10、DV555249.1
11、)设计引物AG0R4□AG0R1,AG0R2分别用于5’RACE的第一轮和第二轮；AG0F1,AG0R3用于扩增EST1和EST2中间未知序列；AG0F2,AG0R4用于扩增EST2和EST3中间未知序列；在AG0F2和AG0R4扩增出来的序列上设计引物AG0F3、AG0F4分别用于3,RACE的第一轮及第二
12、轮，引物序列见表轮程序：94°C2min；94°C循环；94°C45s,70°C
