转Fat-1基因蒙古绵羊胎儿成纤维细胞系的建立.pdf

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1、分类号S827.1学校代码10129UDC11.22学号08201002转Fat-1基因蒙古绵羊胎儿成纤维细胞系的建立EstablishmentofMongolianSheepFetalFibroblastCellLineTransfectedFat-1Gene申请人：薛宏艳学科门类：农学学科专业：动物遗传育种与繁殖研究方向：动物繁殖生物学与繁殖技术指导教师：周欢敏教授论文提交日期：二○一一年五月摘要ω-3多不饱和脂肪酸对于维持有机体的正常生长和发育是必不可少的，然而人体中ω-3PUFAs的含量严重不足，ω-6PUFA

2、s的含量却很高。由于ω-6和ω-3脂肪酸在代谢和功能上截然不同，以及它们具有许多相互对立的生理学功能，因而二者的平衡对有机体的自身稳定和正常发育非常重要。本研究从家畜育种角度出发，把控制ω-6多不饱和脂肪酸转化为ω-3多不饱和脂肪酸的基因Fat-1导入绵羊体细胞，利用体细胞克隆技术创造富含ω-3PUFAs的新型绵羊，培育转Fat-1基因高品质肉羊新品种。实验建立了雄性蒙古绵羊胎儿成纤维细胞系，以秀丽隐杆线虫总RNA为模板合成第一链cDNA，引用设计好的引物扩增cFat-1基因，纯化后连接到pTEK载体构建pTFK-c重

3、组质粒，转化DH-5α感受态细胞后进行重组质粒的提取和测序。然后对核对正确的cFat-1基因进行密码子优化后得到oFat-1，将oFat-1连接到载体pTEK上构建pTEK-o重组质粒，脂质体介导法转染蒙古绵羊胎儿成纤维细胞，经抗生素筛选获得稳定整合Fat-1基因的蒙古绵羊胎儿成纤维细胞。PCR、RT-PCR鉴定结果证明Fat-1基因已整合进入细胞基因组内。作为阶段性成果，本实验获得的转基因阳性细胞可以作为供体进行体细胞核移植，得到整合Fat-1基因的克隆胚胎，为探索通过转基因手段改善羊肉品质奠定坚实的基础。关键词：ω

4、-3多不饱和脂肪酸；Fat-1；pTEK载体；表达EstablishmentofMongolianSheepFetalFibroblastCellLineTransfectedFat-1GeneAbstractOmega-3polyunsaturatedfattyacids(PUFAs)areessentialcomponentsrequiredfornormalcellularfunction,howeverthecontentofω-3PUFAsseriouslyinsufficientinmostpeople,a

5、ndthelevelofω-6PUFAsisrelativelytoohigh.ThesetwoclassesofPUFAsaremetabolicallyandfunctionallydistinctandoftenhaveimportantopposingphysiologicalfunctions;theirbalanceisimportantforhomeostasisandnormaldevelopment.Fromtheperspecticeoflivestockbreeding,wetransfecedF

6、at-1genethatcontrolω-6fattyacidstoω-3polyunsaturatedfattyacidsintosomaticcellsofsheep,andwillcreatesheepofrichinω-3PUFAsusingsomaticcellcloningtechnology,andcultivatehigh-qualitynewvarietiesofsheepwithfat-1gene.Inthisstudy,themaleMongoliansheepfetalfibroblastcel

7、llinewasestablished,withC.eleganstotalRNAastemplate,thefirststrandcDNAwassynthesized,usingprimersdesignedtoamplifycFat-1gene,cFat-1genepurifiedwasconstructedintoexpressionvectorpTEKvectortoconstructtherecombinantplasmidpTFK-c,afterexpressinginEscherichiacoliDH-5

8、α,therecombinantplasmidwasextractedandsequenced.ThencFat-1genewithcodonoptimizationwasnamedoFat-1,oFat-1wasconstructedintoexpressionvectorpTEKvectortoconstructthereco