乙醇消耗菌的分离鉴定及其对基因工程集胞藻乙醇产量的影响-论文.pdf

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1、第38卷第3期水生生物学报Vo1．38，NO．32014年5月ACTAHYDROBIOLOGICASINICAMay，2014doi：l0．7541／2014．69乙醇消耗茵的分离鉴定及其对基因工程集胞藻乙醇产量的影响葛平平，2陈林张维董庆拮刘天中吕雪峰(1．中国科学院青岛生物能源与过程研究所，生物燃料重点实验室，青岛266101；2．中国科学院大学，北京100049)摘要：为研究产乙醇基因工程集胞藻培养液中的乙醇消耗菌污染情况及其对乙醇产量的影响，从污染的培养液中分离出4株乙醇消耗菌，通过16SrDNA、26SrDNA序列分析对分离出的菌株进行鉴定，并研究其

2、乙醇消耗能力及对基因工程集胞藻乙醇产量的影响。结果表明，分离出的4株菌分别为红酵母(Rhodotorulasp．)、季也蒙酵母(Meyerozymaguilliermondii)、短波单胞菌(Brevundimonassp．)、微杆菌(Microbacteriumsp．)。其中乙醇消耗能力最强的是红酵母，乙醇比消耗速率达到391g／(1O"cfu．d)；其次为季也蒙酵母，乙醇比消耗速率为80．1g／(10cfu．d)；短波单胞菌和微杆菌的乙醇比消耗速率远低于红酵母和季也蒙酵母。将分离出的菌株与产乙醇集胞藻共培养7d后，污染红酵母、季也蒙酵母、短波单胞菌、微杆菌

3、的实验组乙醇产量分别下降了53．8％、23．6％、40．7％、27-3％。4株菌对基因工程集胞藻的生长无明显影响，均通过直接消耗乙醇而降低集胞藻的乙醇产量。关键词：乙醇消耗菌；微生物污染；生物乙醇；基因工程集胞藻中图分类号：Q949．22文献标识码：A文章编号：1000—3207(2014)03—0487-08生物乙醇是重要的生物液体燃料之一，可作为巴氏醋杆菌、门多萨假单胞菌等都可代谢乙醇【6一，汽油替代品或可再生交通燃料添加剂]。应用基因其中巴氏醋杆菌的乙醇消耗速率达到2_3mL／d。而工程蓝藻直接利用太阳能和CO2一步法生物合成乙在管囊酵母]、酿酒酵母【¨

4、中，乙醇的合成代谢和醇具有独特的优势，因此成为各界关注的热点【2】。分解代谢同时存在。如果污染了这些微生物，也可目前，用于生产乙醇的基因工程蓝藻主要有聚球藻能严重影响乙醇产量。目前，关于微生物污染对基(Synechococcussp．PCC7942)和集胞藻(Syne．因工程集胞藻乙醇产量的影响还未有报道。chocystissp．PCC6803)E5】等，最高乙醇产量达到本研究从污染的产乙醇基因工程集胞藻的培养5．5g／Lt，显示出太阳能生物转化直接合成乙醇的液中分离出4株乙醇消耗菌，评价各菌的乙醇消耗巨大潜力。然而，有研究表明基因工程集胞藻的乙能力以及对基因

5、工程集胞藻的生长和乙醇产量的影醇产量很不稳定，在培养后期培养液中的乙醇浓度响，并采用形态观察和基因序列分析手段鉴定污染急剧下降【，因此研究确定影响乙醇产量稳定性菌的种类，以期能为蓝藻乙醇的培养工艺及污染控的因素对生产工艺的建立有重要意义。制提供理论参考。在我们的前期工作中发现，基因工程集胞藻在1材料与方法培养过程中易发生食藻生物和微生物污染，尤其是在放大培养阶段这种污染尤为严重。食藻生物会吞1．1藻种及培养方法食藻细胞，使生物量迅速下降，从而降低乙醇产量。产乙醇基因工程集胞藻Synechocystissp．PCC自然界中存在着多种能利用乙醇的微生物，例如醋68

6、03Syn．ZG25，由中国科学院青岛生物能源与过酸菌、面包酵母、嗜有机甲基杆菌、枯草芽孢杆菌、程研究所构建【。集胞藻在250mL三角摇瓶(装液收稿日期：2Ol3-04—10；修订日期：2013—12-25基金项目：国家高技术发展计划(863)(2012AAO52103)资助作者简介：葛平平(1988一)，女，河北保定人；硕士研究生；主要从事生物化工研究。E-mail：gepp@qibebt．ac．cn通信作者：陈林，Tel：0532—80662737；E-mail：chenlin@qibebt．ac．cn488水生生物学报38卷量100mE)或直径3Omm的

7、气泡柱式光反应器(装液提取的基因组DNA为模板，用高保真Taq酶进行量200mL)中培养，通入含5％CO2的空气混合气，PCR扩增。反应条件为：95℃5min；94~C30s，55℃通气速率(10~2)L／h，光强100gmol／(m2．s)，培养温1rain，72℃1min，34个循环；72℃10min。PCR产物度(30~2)℃。培养基为BG11培养基，其中含用0．8％琼脂糖凝胶电泳进行检验。目的基因片段克20mg／L壮观霉素(Spectinomycin，Sigma)。隆：将PCR产物用DNA纯化试剂盒(Cycle．PureKit，1．2乙醇消耗菌的分离纯

8、化美国Omega公司)进行纯化，产物与