锦鲤荧光假单胞菌的分离鉴定及药敏试验-论文.pdf

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1、第33卷第7期水产科学Vo1．33NO．72014年7月FISHERIESSCIENCEJu1．2O14锦鲤荧光假单胞菌的分离鉴定及药敏试验沈晓静，胡秀彩，兰云，李雪，朱爱华，张培，吕爱军(江苏师范大学生命科学学院，江苏徐州221l16)摘要：对锦鲤赤皮病病原菌进行分离鉴定，自患病锦鲤心脏、皮肤病变组织中离到1株革兰氏阴性杆菌(KC—1)，通过细菌形态学观察、生理生化特征、16SrRNA、gyrB基因克隆测序以及构建发育进化树分析，测序结果获得该菌株的16SrRNA、gyrB基因片段大小分别为1501bp、1215bp，与荧光假单胞菌标准菌株LMG583

2、1的16SrRNA序列同源性为99．87，系统发育进化树分析显示KC-1菌株与荧光假单胞菌(登录号：GU19811O)的亲缘关系最近，自然聚类为一支，最终鉴定KC-1菌株为荧光假单胞菌。药敏试验结果显示，KC一1菌株对庆大霉素、丁胺卡那霉素、乙基西梭霉素、诺氟沙星、氧氟沙星、哌拉西林、头孢哌酮、四环素等8种抗生素敏感，对氨苄西林、阿莫西林等24种抗生素耐药。关键词：锦鲤；荧光假单胞菌；分离鉴定；药敏试验中图分类号：$917．1文献标识码：A文章编号：1003一l111(2014)07—0443—04鱼类赤皮病又名出血性腐败病，已成为严重影ic)由本实验室

3、饲养。LB培养基、细菌生化微量鉴响水产养殖业的细菌性疾病之一[x-63。研究表明，定管和药敏试纸均购自杭州微生物试剂有限公司。大鲵(Andriasdavidianus)赤皮病的病原菌为荧光细菌基因组DNA提取试剂盒、DNA胶回收试剂假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)[1]。邓显文盒、pMD18一T、MasterMix均购自上海生工生物技等自发病的罗非鱼(Oreochromis)中分离获得1术服务有限公司。株革兰氏阴性杆菌，确定赤皮病病原菌为荧光假单1．2方法胞菌。张玉明等[5从发病光唇鱼(Aerossocheilus1．2．1细菌的

4、分离鉴定sciatus)体内分离到1株病原菌鉴定为荧光假单参照黄文明等[7方法进行，无菌操作取患病锦胞菌。耿晓修等[63由患病草鱼(Ctenopharyngodon鲤心脏、皮肤等病变组织，接种于LB平板，28℃培idella)分离出荧光假单胞菌，制备甲醛灭活苗对草养18~24h。挑取单菌落接种划线纯化，经2～3鱼免疫，免疫保护率达7O。关于锦鲤(Cyprinus次传代纯化后得到纯菌种，于4℃保藏备用。细菌carpiokoi)赤皮病病原荧光假单胞菌的分离鉴定研接种LB平板上观察菌落，革兰氏染色观察菌体形究，目前尚未见文献报道。2012年10月，江苏省徐态，

5、无菌操作挑取纯化菌株，转接至生化微量鉴定州市某养殖场锦鲤发病，出现鳞片脱落，皮肤、鳍基管中，于28℃恒温培养，连续观察7d并记录结果。出血充血等赤皮病临床症状。笔者以患病锦鲤为1．2．216SrRNA、gyrB基因克隆及序列分析研究对象，通过细菌形态学观察、理化特征、16S参照文献[5，7]方法进行，采用细菌16SrRNA、gyrB基因等系统病原学鉴定，并进行药敏rRNA、gyrB通用引物序列如下：16SrRNA—F：5’试验研究，以期为锦鲤赤皮病的防治提供科学AGTTTGATCATGGCTCAG3’、16SrRNA—R：5’参考。GTTACCTTGTT

6、ACGACTT3’，gyrB—F：5’ACA—ACTCCTACAAGGTCTCCG3’、gyrB—R：5’TCA—1材料与方法GCAGCAGGGTACGGATGT3’。PCR体系：2×1．1材料TaqPCRMasterMix12．5“L，上、下游引物各患病锦鲤为江苏省徐州市某养殖场送检样品，1肛L，DNA模板1肛L，ddH2O9．5L。PCR反应健康鲫鱼购自徐州市某养殖场，斑马鱼(Daniorer-条件：94℃预变性4min、94℃变性40S、55℃退火收稿日期：2013—10—14；修回日期：2014-02-08．基金项目：国家自然科学基金资助项目(3

7、1272692，30800847)；徐州科技局资助项目(XF12C027)．作者简介：沈晓静(1990一)，女，硕士研究生；研究方向：鱼类微生物及免疫学．E—mail：shen5024693@126．com．通讯作者：吕爱军(1973一)，男，副教授；研究方向：鱼类微生物及免疫学．E-mail：lajand@126．com．第7期沈晓静等：锦鲤荧光假单胞菌的分离鉴定及药敏试验游动缓慢，12h注射部位肿胀出血，48h死亡率达1O0，病鱼皮肤呈明显红肿、出血和溃烂症状，对照组正常。斑马鱼创伤浸泡感染，12h开始死亡，0)鱼体创伤部位出血、红肿和溃烂，48h后

8、全部死亡，对照组正常。感染死亡鱼体内均能再分离到荧光假单胞菌，对照组未能分离到荧