土壤中荧光假单胞菌的分离及鉴定

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1、微生物学实验方案土壤中荧光假单胞菌的分离及鉴定实验方案本组成员：张清玫、赵良燊、周红梅联系方式：177805179431微生物学实验方案一、实验目的1.1学习和掌握培养基的一般配置方法和步骤1.2学习和掌握分离纯化技术的概念1.3学习掌握涂布稀释分离微生物的技术1.4学习假单胞菌属的生活习性和主要种类1.5较为深入了解荧光假单胞菌的生物学特性和应用二、实验原理2.1荧光假单胞菌2.1.1荧光假单胞菌（P.Fluorescens），分类学上属于细菌域、变形菌门、γ-变形菌纲、假单胞菌目、假单胞菌科的假单胞菌属。细胞为直的杆菌，大小为0.7-0.8

2、X2.3-2.8微米，不产芽孢，革兰氏染色阴性。有数根极生鞭毛，运动。需氧,进行严格的呼吸型代谢,以氧为最终电子受体。能以硝酸盐为替代的电子受体进行厌氧呼吸。化能营养异养，不需要有机生长因子。氧化酶阳性，接触酶阳性。能利用葡萄糖和果糖，有些菌株能从蔗糖合成果聚糖，明胶液化。生长温度范围4-37℃，最适生长温度是25-30℃。DNA中G+C含量是60-61%。广泛分布于自然界，如土壤、水、植物及动物活动环境中。该菌生化能力活跃，可降解许多人工合成化合物，常被用于环境保护。能分泌黄绿色荧光色素发出荧光，能产生抗生素、水解酶等代谢产物，在4℃-37℃

3、范围内，中性环境中生长，生理生化特性显著，是作为嗜冷菌是牛奶中危害最大的微生物。2.1.2荧光假单胞菌抑菌活性的最佳发酵配方和培养条件为：果糖1.5％、蛋白胨3.0％、KH2PO40.1％、NaCl0.04％、CaCO30.1％，起始pH为7.2，装瓶量50ｍＬ／250ｍＬ，28℃，200r／min，种子液接种量为10％，摇瓶培养4d。2.2平板划线分离法平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求,或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而

4、淘汰一些不需要的微生物。平板划线分离法是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯本组成员：张清玫、赵良燊、周红梅联系方式：177805179432微生物学实验方案种。有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的2.3荧光假单胞菌的鉴定在KMB培养基上培养24h后可形成1.2mm菌落，菌落可产生橙色色素，

5、圆形，表面凸起，光滑，较粘稠，易挑起，边缘整齐。在电镜下观察可看到细菌发出黄绿色荧光。三、实验材料试剂与器具3.1实验材料江安校园植物根部附近土壤3.2实验试剂3.2.1KMB培养基配方如下：蛋白胨20g，磷酸氢二钾1.5g，硫酸镁1.5g，琼脂10g，无菌水1000ml。pH值7.2±0.2。3.2.2十六烷基三甲基溴化铵琼脂配方如下蛋白胨10g；牛肉膏3g；氯化钠5g；琼脂13g；十六烷基三甲基溴化铵0.3g；pH7.5±0.1。3.3实验器材移液枪，试管，锥形瓶，量筒，天平，钥匙，剪刀，锡纸，标签纸，线绳，酒精灯，石棉网，借种环，培养皿等

6、。四、实验步骤4.1KMB培养基配制按培养基配方比例依次推确地称取蛋白胨20g，磷酸氢二钾1.5g，硫酸镁1.5g，放人盛有100ml无菌水的锥形瓶溶解。手摇锥型瓶使之完全溶解。溶解后定容至250ml。取出20ml于试管中盖好盖子，向锥型瓶是剩余的液体中加入10g琼脂加热溶解。本组成员：张清玫、赵良燊、周红梅联系方式：177805179433微生物学实验方案4.2十六烷基三甲基溴化铵琼脂配制按培养基配方比例依次推确地称蛋白胨10g；牛肉膏3g；氯化钠5g；十六烷基三甲基溴化铵0.3g；放人盛有50ml无菌水的锥形瓶溶解，定容至100ml。混合溶

7、解后加入琼脂13g加热溶化。4.3灭菌将上述培养基以0.103MPa，121℃，20min高压蒸气灭菌。4.4倒平板待其冷却至45℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成平板。配制KB培养基16个，十六烷基三甲基溴化铵琼脂3个。倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将轻轻地拨出，瓶口保持对着火焰；然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹住管瓶塞(也可将瓶塞放在左手边缘或小指与无名指之间夹住。如果试管内或三角瓶内的培养基一次用完，管塞或瓶塞则不必夹在手中)。左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅

8、速例入培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。4.5无菌检查将灭菌培养基放人=温室中培