阳春砂实时荧光定量PCR内参基因的筛选-论文.pdf

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1、广州中医药大学学报2014年9月第31卷第5期814JournalofGuangzhouUniversityofTraditionalChineseMedicineSeptember2014，Vo1．31，No．5．南药园地．阳春砂实时荧光定量PCR内参基因的筛选于安民1,2，王焕1,2，何雪莹1,2，邓可1,2，詹若挺1,2，杨锦芬1,2(1．广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心，广东广州510006；2．岭南中药资源教育部重点实验室(广州中医药大学)，广东广州510006)摘要：【目的】筛选稳定表达的内参基因，用于阳春砂不同发育时期的果皮和种子团中

2、基因表达量实时荧光定量PCR(qRT—PCR)检测的校正。【方法】以阳春砂3个不同发育时期的果实(分为果皮和种子团)为材料，根据高通量测序得到的转录组和表达谱数据．选择5个表达稳定的常用内参基因／3一actin、肼J、GAPDH、PGK和TUA作为候选基因，并利用qPCR技术检测它们在不同样品中表达水平的变化，使用GeNorm和NormFinder软件对基因的稳定性进行分析。【结果】5个内参基因在不同发育时期的果皮和种子团中的表达稳定性有明显的差异，其中GeNonn分析得到的内参基因的稳定顺序为：EJ=TUA>PGK>GAPDH>fl—actin，Norm

3、Finder的分析结果中稳定性最好的是倒1_Jd，其次为TUA，其他3个内参基因稳定性的排列顺序与GeNoriB软件的结果一致【结论】可选用EJd和TUA作为阳春砂果实发育过程中基因表达量差异分析的双内参基因。关键词：阳春砂；荧光定量PCR；内参基因；基因表达；果实中图分类号：R284．1文献标志码：A文章编号：1007—3213(2014)05—0814—06DoI：10．13359~．cnki．gzxbtcm．2014．05．029阳春砂(Amomumvillo．sumLour．)是中药砂仁cGMP一依赖性蛋白激酶I(cGMP—dependentpro

4、tein的主要来源植物．以干燥成熟果实入药．具有化湿kinaseI，PGK)、仅一微管蛋白(一tubulin，TUA)、开胃、温脾止泻、理气安胎之功效[1j。随着分子生转录延伸因子一1仅ftranscriptionelongationfactor—物学技术的发展．通过实时荧光定量PCRfreal—l仪。肼1_J)5个内参基因的表达稳定性，为阳春timefluorescencequantitativePCR．qRT—PCR)技术砂基因表达量分析中内参基因的选择提供依据．现分析基因表达量的方法已被广泛应用目前．对阳报道如下春砂萜类生物合成途径中功能基因的研究已

5、较为深人．已克隆获得了阳春砂的3一羟基一3一甲基戊二酰1材料与方法辅酶A还原酶(3一hydroxy'3一methylglutaryl—CoA1．1材料阳春砂果实采自广东省阳春市春湾堰reductase，HMGR)．1一去氧一D一木酮糖一5～磷酸还垌春砂仁生产基地．由广州中医药大学詹若挺研究原异构酶(1一deoxy—D—xylulose一5一phosphate员鉴定为A．rilloumLour．的新鲜果实分别采集reductoisomerase．DXR)和1一去氧一D一木酮糖一5一幼果期果实(30DAF，DAF指开花后的天数)、成磷酸合成酶(1一deoxy—

6、D—xylulose一5一phosphate熟中期果实(60DAF)、成熟末期果实(90DAF)，synthase．DXS)等[2-3]关键酶基因．但在qPCR实验果实采下经简单清洁后用液氮冷冻．包埋于干冰中中．为了尽可能排除样本上的差异而测得准确的基运输．贮存于一80％因表达量．需要选择稳定的内参基因进行数据的校1．2试剂与仪器植物总RNA提取试剂盒(北正[41。京奥莱博生物技术有限公司)：RN38一EASYspin本研究以阳春砂3个不同发育时期的果实(分Plus植物RNA快速提取试剂盒f北京艾德莱生物为果皮和种子团)为材料，采用qPCR技术分析B一科技

7、有限公司)；PrimeScriptRTreagentkitwith肌动蛋白(一actin)、甘油醛一3一磷酸脱氢酶gDNAEraser试剂盒、PrimeSTARMaxDNA(glyceraldehyde一3一phosphatedehydrogenase，GAPDH)、Polymerase、PremixExTaq(大连宝生物工程有限收稿日期：2014—04—11作者简介：于安民(1987一)，女，硕士研究生；E-mail：764887373@qq．con通讯作者：杨锦芬(1978一)，女，研究员；E-mail：yangjf@gzucm．edu．en基金项目：

8、国家自然科学基金资助项目(编号：81303163)第5期于安民．等