体外培养细胞内乙肝病毒共价闭合环状DNA检测方法的建立-论文.pdf

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1、重庆医科大学学报2013年第38卷第l2期(JournalofChengqingMedicalUniversity2013．VO1．38N0．12)一1393一技术苘l沿DOI：10．11699／cyxb20131201体外培养细胞内乙肝病毒共价闭合环状DNA检测方法的建立黄荣，陈江燕，胡接力，罗英英，黄爱龙(重庆医科大学感染性疾病分子生物学教育部重点实验室，重庆400016)【摘要】目的：建立一种体外培养细胞内乙肝病毒(hepatitisBvirus，HBV)共价闭合环状DNA(covalentlyclosedcircularDNA，cccDNA)的检测方法。方法

2、：Southernblot检测HBV复制中间体，以确认HepAD38、HepG2．2．15和P+P一细胞是否支持HBV复制；用Hirt法分别提取细胞内的去蛋白DNA(protein—freeDNA，PFDNA)，经加热变性处理，0RI酶切，然后用Southernblot检测HBVcccDNA：用同样方法检测不同培养时间的HepAD38细胞内cccDNA，观察培养时间对cceDNA积累量的影响。结果：用Southeinblot可在HepAD38、HepG2．2．15和P+P一细胞中检测到HBV复制中间体；Hirt法提取物经变性和酶切处理，可有效地将cccDNA与其他形

3、式HBVDNA区分开；HepAD38、HepG2．2．15和P+P一细胞内均可检测到HBVcccDNA；HepAD38细胞在铺满后继续培养的时间较长时，其细胞内cccDNA的量较多。结论：成功建立了体外培养细胞内HBVcccDNA检测方法，该方法结合Hirt提取法和地高辛探针Southernblot方法，能可靠、准确地检测HBVcccDNA。【关键词】乙型肝炎病毒；共价闭合环状DNA；Southernblot【中国图书分类法分类号]R373．21【文献标志ti-~]A【收稿日期】2013—04—22AmethodfordetectingintracellularHB

4、VcovalentlyclosedcircularDNAinculturedcellsinvitroHUANGRong，CHENJiangyan，HUJieli，LUOYingying，HUANGAilong(KeyLaboratoryofMolecularBiologyonInfectiousDiseases，MinistryofEducation，ChongqingMedicUniversity)【Abstract]Objective：ToestablishamethodfordetectinghepatitisBvirus(HBV)covalentlyclos

5、edcircularDNA(cecDNA)incul—turedcellsinvitro．Methods：SouthernblotwasusedtodetecttheHBVreplicationintermediatesfromHepAD38，HepG2．2．15andP+P—celllinestoconfirmtheircapabilityofsupportingHBVreplication．Extractionofprotein—freeDNA(PFDNA)wasea~iedoutwithamodifiedHirtextractionprocedurefromH

6、epAD38．HepG2．2．15andP+P—cells，whichwereculturedforseveraldaysafterthecellsgrowingtoconfluence．ThecccDNAwasthermallydenaturedandthensubjectedtoEcoRIdigestionbeforeSouthernblotanalysis．DynamicchangesofHBVcccDNAinHepAD38cellsatdifferentgrowthtimewereexamed．Results：HBVreplicationintermedia

7、tesweredetectableinHepAD38，HepG2．2．15andP+P-cellsbySouthernblot．HBVcccDNAextractedfromHepAD38，HepG2．2．15andP+P——cellscanbeeffectivelydistinguishedfromotherformsofHBVDNAinSouthernblot．AlargeramountofHBVcccDNAwasdetectedwhenHepAD38cellsgrewmoretimeafterconfluence．Conclusions：Amethodfor