浅析低氧促进体外培养的星形胶质细胞内β

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1、浅析低氧促进体外培养的星形胶质细胞内β【摘要】目的探讨低氧对星形胶质细胞内β-catenin积聚的机制。方法体外分离昆明小鼠海马星形胶质细胞，分别置于常氧和低氧条件下培养12h和24h后，利用RT-PCR和Westernblot法检测星形胶质细胞内Wnt通路相关蛋白Wnt3、Wnt3a及磷脂酰肌醇-3激酶/Akt(PI3K/Akt)通路中磷酸化Akt(p-Akt)和磷酸化糖原合成酶激酶-3β(p-GSK-3β)蛋白的表达情况。结果常氧培养的海马星形胶质细胞内存在Wnt3的表达，低氧对海马星形胶质细胞内Wnt3的表达

2、无影响(P>);常氧和低氧培养的海马星形胶质细胞内均不存在Wnt3a表达;低氧增加海马星形胶质细胞的p-Akt和p-GSK-3β蛋白水平(P【关键词】低氧;星形胶质细胞;Wnt;β-catenin;Akt;GSK-3βABSTRACT:ObjectiveToexplorethemechanismofhypoxia-promotedaccumulationofβ-catenininwereisolated,culturedandidentifiedfromKunmingmousehippocampusinvitro,

3、thenculturedinhypoxiaandtraditionaloxygenforhoursand1hours,respectively.TheexpressionsofWntandWnt3ainhippocampusastrocytesweredetectedbyRT-PCR.TheeffectofhypoxiaontheexpressionsofWntandWnt3ainhippocampusastrocyteswasanalyzedbyRT-PCR.Theinfluenceofhypoxiaonthee

4、xpressionsofphosphorylatedAktandglycogensynthasekinase-3β(GKS-3β)protEinwasanalyzedbyWesternexpressedinhippocampusastrocytesandhypoxiadidnotaffectitsexpression(P>).Wnt3awasnotdetectedinhippocampusastrocytesintraditionalcultureorhypoxicculturecondition.Hypoxiap

5、romotedthelevelofphosphorylatedAktandGKS-3βprotEIn(PKEYWORDS:hypoxia;astrocyte;Wnt;β-catenin;Akt;glycogensynthasekinase-3β(GSK-3β)低氧预适应是指轻度低氧和短暂缺血的重复预处理触发和动员机体内在的防护能力，从而对随后的严重低氧或缺血损伤产生强大的防御和保护作用[1]。在整体动物脑缺血预适应中，星形胶质细胞可能释放多种因子，作用于神经元[2-3]，但其具体的作用机制尚不清楚。研究表明，在低氧

6、预处理后离体及在体动物均发生反应性星形胶质细胞增生，其作用可能与β-catenin的过度激活有关[4-5]。我们在前期工作中亦发现，β-catenin可促进(30±20)mL/L低氧条件下体外培养的神经前体细胞和胶质前体细胞增殖，并可在低氧培养的星形胶质细胞中积聚[6]，但其作用机制尚未明确。本实验选用海马星形胶质细胞，探讨低氧培养条件下，星形胶质细胞内β-catenin积聚的可能机制。1材料与方法材料DMEM/F12、胎牛血清(FBS)购自Hyclone公司，兔抗胶质原纤维酸性蛋白(glialfibrillary

7、acidicprotein,GFAP)多抗购自Sigma公司，羊抗β-catenin抗体、兔抗β-actin抗体、抗磷酸化Ser9位点GSK-3β单克隆抗体、抗磷酸化Ser473位点Akt单克隆抗体(SantaCruz)、辣根过氧化物酶标记兔抗山羊IgG、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG购自SantaCruz公司，SuperSignalWestPico化学发光检测底物试剂盒购自Pierce公司，RT-PCR试剂盒、Trizol购自Invitrogen公司，SP免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒购自北京中杉公司，新生昆

8、明小鼠由南京军区福州总医院比较医学科提供，SPF级。方法昆明小鼠海马星形胶质细胞的分离、培养及鉴定选用2d龄小鼠，750mL/L乙醇浸泡消毒后迅速断头取脑，置于盛有D-Hanks液的玻璃培养皿中，用眼科剪剪去头部皮肤和颅骨，仔细去除脑膜和血管，剥离出大脑半球，用D-Hanks液清洗2次;在解剖显微镜下小心分离海马组织，置于另一盛有D-Hanks液的培养