低氧促进体外培养的星形胶质细胞内β

《低氧促进体外培养的星形胶质细胞内β》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、低氧促进体外培养的星形胶质细胞内β低氧预适应是指轻度低氧和短暂缺血的重复预处理触发和动员机体内在的防护能力，从而对随后的严重低氧或缺血损伤产生强大的防御和保护作用[1]。在整体动物脑缺血预适应中，星形胶质细胞可能释放多种因子，作用于神经元[2-3]，但其具体的作用机制尚不清楚。研究表明，在低氧预处理后离体及在体动物均发生反应性星形胶质细胞增生，其作用可能与β-catenin的过度激活有关[4-5]。我们在前期工作中亦发现，β-catenin可促进(30±20)mL/L低氧条件下体外培养的神经前体细胞和胶质前体细胞增殖，并可在低氧培养的星

2、形胶质细胞中积聚[6]，但其作用机制尚未明确。本实验选用海马星形胶质细胞，探讨低氧培养条件下，星形胶质细胞内β-catenin积聚的可能机制。　　1材料与方法　　1.1材料DMEM/F12、胎牛血清(FBS)购自Hyclone公司，兔抗胶质原纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein,GFAP)多抗购自Sigma公司，羊抗β-catenin抗体、兔抗β-actin抗体、抗磷酸化Ser9位点GSK-3β单克隆抗体、抗磷酸化Ser473位点Akt单克隆抗体(SantaCruz)、辣根过氧化物酶标记兔抗山羊IgG、

3、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG购自SantaCruz公司，SuperSignalEM/F12培养基终止消化，巴氏吸管吹打，200目不锈钢筛X过滤，制备混合细胞悬液;收集于无菌离心管中，1000r/min离心5min，弃上清。加入含100mL/LFBS的DMEM/F12培养基，将细胞密度调整为3～5×105个/mL，接种于50mL培养瓶内。置于37℃，饱和湿度，50mL/LCO2培养箱中培养，2～3d后换液。　　1.2.2星形胶质细胞的纯化及鉴定培养7d后，贴壁细胞融合达90%以上，利用胰酶消化法传代，继续培养，连续传代3次后，所得细胞

4、即是星形胶质细胞。鉴定时，将细胞接种于12孔板内的盖玻片上，3d后取出爬满细胞的盖玻片，进行GFAP免疫细胞化学鉴定(SP法)，步骤简述如下：PBS漂洗，以40g/L多聚甲醛液固定30min;PBS漂洗，5min×2次;30mL/LH2O2孵育5min;滴加封闭用正常山羊血清工作液，室温孵育15min;倾去，勿洗;滴加兔抗GFAP多克隆抗体(1∶100)，置于湿盒内4℃过夜;PBS洗，3min×3次;滴加生物素标记的山羊抗小鼠IgG，37℃孵育60min;PBS洗，3min×3次;滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃孵育60min;P

5、BS冲洗，3min×3次;DAB显色后脱水，透明封片并镜检。阴性对照将PBS替换一抗，其余步骤相同。　　1.2.3星形胶质细胞的低氧培养将6孔板内的细胞置于50mL/LO2，50mL/LCO2/N2的低氧培养箱内培养12h和24h后，待细胞密度达80%以上融合后，取出细胞，进行相关指标检测。常氧培养的细胞为对照组，各组细胞各取3孔，分别进行3次实验。　　1.2.4RT-PCR法检测星形胶质细胞中V反转录酶，4.0μL25mmol/LMgCl2，4.0μL5×buffer，加灭菌三蒸水至总体积20μL，42℃1h，选定扩增循环数为30。取

6、逆转录cDNA4.0μL，10×扩增缓冲液5.0μL，MgCl23.0μL，dNTP3.0μL，上、下游引物10pmol，TaqDNA聚合酶1.0μL，加灭菌三蒸水至总体积50.0μL。在PCR仪上扩增，反应条件：94℃5min，94℃30s，55℃(arker;2、4：常氧组yc)的表达促进细胞增殖。本研究发现β-catenin可在低氧培养的星形胶质细胞内积聚。yc)。β-catenin在经典Wnt信号通路中处于中心地位，其激活或降解会导致Wnt信号通路变化[9-10]。人类基因组中已经发现Wnt基因19种，分别命名为Wnt1、Wnt

7、2、Wnt3、Wnt3a等[11]。LIE等[12]报道检测到成体海马内星形胶质细胞具有表达Wnt3的能力。本实验采用传代培养筛选获取海马星形胶质细胞，分别于常氧和低氧条件下培养。RT-PCR检测结果表明，常氧培养的成体海马星形胶质细胞内表达Wnt3，但Wnt3a无表达。低氧培养时，仍未检测到Wnt3a的表达，而Wnt3的表达下降。表明低氧条件并未上调海马星形胶质细胞内主要的Wnt蛋白的表达。因此，推断在低氧情况下可能存在其他未知的引发β-catenin积聚的因素。学术论文发表　　PI3K/Akt信号转导通路是一条参与细胞增殖调控的重要

8、信号通路。PI3K和Akt是该通路的中心环节。研究证实PI3K/Akt信号通路不仅参与胚胎干细胞的增殖分化调控，而且参与多种细胞缺氧后的增殖[13]。但是，对于该信号途径在星形胶质细胞的作用知之甚少。Akt