浅析低氧促进体外培养的星形胶质细胞内β的论文

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1、浅析低氧促进体外培养的星形胶质细胞内β的论文【摘要】目的探讨低氧对星形胶质细胞内β-catenin积聚的机制。方法体外分离昆明小鼠海马星形胶质细胞，分别置于常氧和低氧条件下培养12h和24h后，利用rt-pcr和echanismofhypoxia-promotedaccumulationofβ-catenininastrocytes.methodsastrocyteskunmingmousehippocampusinvitro,thenculturedinhypoxiaandtraditionaloxygen

2、for24hoursand12hours,respectively.theexpressionsofpusastrocytespusastrocytespusastrocytesandhypoxiadidnotaffectitsexpression(p>0.05).pusastrocytesintraditionalcultureorhypoxicculturecondition.hypoxiapromotedthelevelofphosphorylatedaktandgks-3βprotein(p&l

3、t;0.05).conclusionhypoxiaincreasestheexpressionofβ-catenininastrocytesthroughpromotingthelevelofphosphorylatedaktandgks-3βproteininvitro.　　keyl/l低氧条件下体外培养的神经前体细胞和胶质前体细胞增殖，并可在低氧培养的星形胶质细胞中积聚[6]，但其作用机制尚未明确。本实验选用海马星形胶质细胞，探讨低氧培养条件下，星形胶质细胞内β-catenin积聚的可能机制。　　1材料与

4、方法　　1.1材料dmem/f12、胎牛血清(fbs)购自hyclone公司，兔抗胶质原纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein,gfap)多抗购自sigma公司，羊抗β-catenin抗体、兔抗β-actin抗体、抗磷酸化ser9位点gsk-3β单克隆抗体、抗磷酸化ser473位点akt单克隆抗体(santacruz)、辣根过氧化物酶标记兔抗山羊igg、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔igg购自santacruz公司，supersignall/l乙醇浸泡消毒后迅速断头取脑，置于盛有d

5、-hanks液的玻璃培养皿中，用眼科剪剪去头部皮肤和颅骨，仔细去除脑膜和血管，剥离出大脑半球，用d-hanks液清洗2次;在解剖显微镜下小心分离海马组织，置于另一盛有d-hanks液的培养皿中。用眼科剪将海马组织剪碎成糊状，转移至带螺帽的离心管内，加入终浓度为1.25g/l胰酶，置于37℃水浴消化15～30min，每隔5min振荡1次，以含100ml/lfbs的dmem/f12培养基终止消化，巴氏吸管吹打，200目不锈钢筛网过滤，制备混合细胞悬液;收集于无菌离心管中，1000r/min离心5min，弃上

6、清。加入含100ml/lfbs的dmem/f12培养基，将细胞密度调整为3～5×105个/ml，接种于50ml培养瓶内。置于37℃，饱和湿度，50ml/lco2培养箱中培养，2～3d后换液。　　1.2.2星形胶质细胞的纯化及鉴定培养7d后，贴壁细胞融合达90%以上，利用胰酶消化法传代，继续培养，连续传代3次后，所得细胞即是星形胶质细胞。鉴定时，将细胞接种于12孔板内的盖玻片上，3d后取出爬满细胞的盖玻片，进行gfap免疫细胞化学鉴定(sp法)，步骤简述如下：pbs漂洗，以40g/l多聚甲醛液固定30min;p

7、bs漂洗，5min×2次;30ml/lh2o2孵育5min;滴加封闭用正常山羊血清工作液，室温孵育15min;倾去，勿洗;滴加兔抗gfap多克隆抗体(1∶100)，置于湿盒内4℃过夜;pbs洗，3min×3次;滴加生物素标记的山羊抗小鼠igg，37℃孵育60min;pbs洗，3min×3次;滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃孵育60min;pbs冲洗，3min×3次;dab显色后脱水，透明封片并镜检。阴性对照将pbs替换一抗，其余步骤相同。　　1.2.3星形胶质细胞的低氧培养将6孔板内的细胞置于50ml/

8、lo2，50ml/lco2/n2的低氧培养箱内培养12h和24h后，待细胞密度达80%以上融合后，取出细胞，进行相关指标检测。常氧培养的细胞为对照组，各组细胞各取3孔，分别进行3次实验。　　1.2.4rt-pcr法检测星形胶质细胞中erpremier5.0设计引物，由赛百盛生物技术有限责任公司合成(表1)。cdna合成和pcr扩增反应：2.0μgrna，2.0μloligo(dt)15，2.0μld