人骨保护素在 CHO 细胞内初步稳定表达-论文.pdf

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1、中国骨质疏松杂志2014年6月第2O卷第6期ChinJOsteoporos⋯June14，V．Publishedonlinewww．wanfangdate．COITI．cndoi：10．3969／ii：QQ：：：Q611·论著·人骨保护素在CHO细胞内初步稳定表达孟凡星李瑞香臧晓怡1．河北省承德医学院病理生理学教研室，河北承德0670002．天津医科大学内分泌研究所，天津300070中图分类号：R34文献标识码：A文章编号：1006-7108(2014)06-0611一D4摘要：目的构建人OPG的稳定表达载体，并在DHFR一型CHO细胞内稳定表达。方法用RT—PCR的方法获得人全长

2、OPG的编码基因，并将其克隆入载体pcDNA3．1zDHFR／CT—GFP，鉴定无误后，转染DHFR一型CHO细胞，经MTX筛选获得阳性表达OPG的细胞株。结果成功构建人OPG的稳定表达载体，并获得阳性表达OPG的细胞株。结论全长人OPG基因可以在CHO细胞内成功稳定表达，这为OPG的功能研究及临床应用奠定物质基础。关键词：骨保护素；二氢叶酸还原酶；中国仓鼠卵巢细胞；MTXPreliminarystableexpressionofhumanOPGintheCHOcellMENGFanxing，LIRuixiang，ZANGXiaoyi1．DepartmentofPathoph【ys

3、iology，ChengdeMedicalCollege，Chengde0670002．InstituteofEndocrine，TianjinMedicalUniversity，Tianjin300070，ChinaCorrespondingauthor：ZANGXiaoyi，Email：zangxy@tijmu．edu．cnAbstract：0bjecfiveToconstructthestableexpressionvectorofthehumanOPG，andtodetectitsstableexpressioninDHFR—typeCHOceils．MethodsThef

4、ull-lengthhumanOPGgenewasobtainedusingRT—PCRmethod．ThegenewasclonedintothevectorpcDNA3．1-DHFR／CT—GFP．Afteridentification，thevectorwastransfectedintoDHFR—typeCHOcells．TheCHOceilswithpositiveexpressionofOPGwereselectedusingMTXscreening．ResultsThestableexpressionvectorofthehumanOPGwassuccessfully

5、constructed，andtheCHOceilswithpositiveexpressionofOPGwerealsoobtained．ConclusionThefull—lengthhumanOPGgenecanbestablyexpressedintheCHOcells，whichprovidesafoundationforthefunctionalresearchandclinicalapplicationofOPG．KeyWOrds：OPG，DHFR，CH0，MTX骨保护素(osteoprotegerin，OPG)是在破骨细胞1材料和方法的分化和发育过程中具有重要作用的

6、细胞因子。它可抑制破骨细胞分化和发育，抑制骨质疏松的发1．1材料生¨卫。体外表达具有天然结构及活性的OPG，对1．1．1生物材料：大肠杆菌TOP10购自InvitrogenOPG的基础和临床的应用研究具有十分重要的意公司，质粒载体pcDNA3．1．DHFR／CT．GFP为在义。Invitrogen公司产品pcDNA3．1／CT—GFP的基础上用为了获得大量具有天然生物活性的OPG，本研鼠源二氢叶酸还原酶基因构建。二氢叶酸还原酶缺究利用中华仓鼠卵巢细胞(CHO)系统初步表达了陷型中国仓鼠卵巢细胞(CHO-dhfr一)购自ATCC。OPG，同时用MTX加压，筛选，初步得到了稳定表达人新

7、鲜肾组织来自临床肾全切手术病人的肾皮质，OPG的细胞株，为将来大规模生产具有天然结构和冻存于液氮中。功能活性的OPG奠定了基础。1．1．2试剂与仪器：AMV逆转录酶试剂盒购自Promeg公司，限制性内切酶、T4DNA连接酶、DNA基金项目：天津市自然科学基金重点项目(013803511)；河北MarkerDL2000、dNTPMixture购自大连TaKaRa省教育厅课题项目(Z2010110)Bioteeh公司。pfuDNA聚合酶购自上海生工生物公{通讯作者：臧晓怡