抗cd20抗体在cho细胞内的高表达及其定点偶联mmae的初步研究

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1、万方数据擅￡墅2Q擅篮查g塾Q缉胞卤的壶塞达丞基定壶堡送丛必煎垫生盟窒⑧指导教师签名：论文评阅人1：廑国渲∑遨援∑浙江三些太堂荭堂暄评阅人2：筮睦丞∑熬援∑逝江太堂生佥盈堂堂瞳评阅人3：金丞堂∑敛控∑浙江太堂医堂瞳答辩委员会主席：吴丞鎏∑敛援∑逝婆太堂荭堂睦委员1：叠垒进垫撞∑教援∑逝江太堂医堂睦委员2：虚金彪∑敛援∑泣江太堂医堂睦委员3：委员4：委员5：万方数据浙江大学研究生学位论文独创性声明IYttllllt2lllllll9lllltl9llttl2／lll2llllllt8lllll3llllll本人

2、声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得浙婆太堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：砍悬签字日期：矽c垆年害月睦日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解逝婆太堂有权保留并向国家有关部门或机构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权浙鎏太堂可以将学位论文的全部或部分

3、内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：导师签名：签字日期：汐f垆年；月l刍日签字日期：≯乒年歹月∥日万方数据浙江大学硕士学位论文致谢值此毕业答辩之际，首先衷心感谢我的导师陈枢青教授!感谢陈老师在课题设计和科研思路上对我的悉心指导，感谢陈老师在生活上给予我的关怀。陈老师思维敏捷、学识渊博、治学态度严谨，从事科研充满不停探索的激情、勇气与活力同时又务实求真踏实谨慎，对科研的热爱和积极进取永不止步的精神以及对社

4、会的责任感和使命感一直激励着我。所有恩情学生铭记于心，谨向恩师表示衷心的感谢。感谢徐迎春老师在繁忙工作的同时，给予我诸多帮助和照顾。感谢实验中心的孙红颖老师和马丽老师在实验过程中给予我的帮助。感谢浙江海正药业有限公司的王海彬和缪士伟在实验过程中给予的支持；感谢惠觅宙实验室在载体构建以及单克隆筛选方面给予的技术指导和支持!我还要特别感谢李朝辉和徐晓倩在实验上对我的帮助。感谢沈其、吴敏、潘利强、雷雅静、谢章明、张书杰、唐晓婧、刘文慧、来骏、周丽芳、韦小越等生化药学实验室的师兄师姐师弟师妹在工作以及生活中的热心帮助

5、，使我得以顺利完成论文。同时感谢药分实验室的同学给予我实验上的帮助。感谢我所有的朋友，谢谢你们在生活中给予我鼓励和帮助!最后，还要感谢家人对我一．贯的支持、鼓励和宽容，是你们用自己的汗水和爱心，铸成我今日的成长，谢谢你们!张骞于浙大紫金港万方数据浙江大学硕士学位论文中文摘要抗CD20抗体在CHO细胞内的高表达及定点偶联MMAE的初步研究浙江大学药学院硕士生张骞导师陈枢青教授中文摘要一．应用GC．rich载体提高CHO细胞表达抗CD20抗体的能力构建合适的高表达载体是提高CHO等哺乳动物细胞表达外源重组蛋白能力

6、的有效手段。目前工业生产上使用最多的高表达载体主要有两类：一类以二氢叶酸还原酶(dihydrofolatereductasc，DHFR)为筛选因子；另一类则以谷氨酰胺合成酶(Glutaminesynthetase，GS)为筛选因子。这两类载体都是基于基因共扩增的原理达到增加目的基因拷贝数进而提高表达量的目的，但是这两类载体都存在筛选过程冗长，同时筛选压力移除后表达不稳定的问题。因此开发新型的高表达载体依然是我们所面临的任务。大量文献已经报道sp家族蛋白和Krfippel家族蛋白是真核细胞中两类十分重要的转录因

7、子，它们被证实通过与GCbox相结合调节目的基因的表达水平。基于上述事实，本实验通过在普通载体的表达框附近添加富含GC的片段构建了GC—rich载体，并用该载体分别携带抗CD20抗体的轻链基因和重链基因，共转染进CHO细胞中，经G418筛选两周，随机克隆，并且与GC—rich(一)对照载体进行同步比较，结果显示使用GC—rich载体挑取的克隆阳性率为47％(45／96)，而使用对照载体筛选到阳性克隆率仅为6％(6／96)；ELISA同步检测，OD450最大值分别为0．62和0．37。继续将所挑取的高表达细胞克

8、隆(CHO．2F2一K2)放大培养，表达3天，可获得抗体表达量为33mg／L，比本实验室原先的抗体表达水平提高10倍以上。由此，我们初步得到以下结论：GC—rich片段不仅增加了筛选克隆的阳性率，并且确实一定程度上提高CHO细胞表达抗CD20抗体的能力。lI万方数据浙江大学硕士学位论文中文摘要二．CHO细胞悬浮培养抗体表达过程中，活细胞的密度是影响表达量的重要因素之一。为了进一步提高抗CD20抗体的