新型抗cd20人源化抗体的表征结构分析

《新型抗cd20人源化抗体的表征结构分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、第二军医大学硕士学位论文新型抗CD20人源化抗体的表征结构分析姓名：郭清城申请学位级别：硕士专业：肿瘤学指导教师：郭亚军201205新型抗CD20人源化抗体的表征结构分析摘要研究目的：非霍奇金淋巴瘤(NHL)是最常见的淋巴系统恶性肿瘤，好发于青壮年，其中绝大多数为B细胞来源，约占85％。CD20分子在95％以上的B细胞性NHL中均有表达，且抗原分子在膜上比较暴露，容易接近，与单抗结合后无显著内化和脱落，也不会因与抗体的结合而发生抗原调变，因此成为治疗B细胞淋巴瘤的理想靶点。目前已有人鼠嵌合抗CD20抗体上市(鼬tuXimab—C288)。尽管黜tlⅨima

2、b在临床治疗中已显示出较好的疗效，仍有部分的患者对Rituximab的治疗不产生反应，且单独使用该药治愈率仅为10％，大部分患者会产生复发和抵抗，并且具有产生人抗鼠抗体(HAMA)反应的潜在风险。基于此，本实验室重新构建并表达了全新的重组抗CD20人源化单克隆抗体，以期进一步提高抗体的功能，降低HAMA反应的风险。本研究首次通过超高压液相色谱串联四级杆飞行时间质谱(LC．ESI．Q．Tof)技术从不同水平对重组抗CD20人源化单克隆抗体的结构进行了详细的分析鉴定，并进行了体外生物活性的分析，为下一步的临床前和临床研究奠定了良好基础。研究方法：●SDS．PA

3、GE和HPLC．SEC分析重组抗CD20人源化单克隆抗体的表观分子量和纯度。·LC朋S在完整蛋白水平上分析莺组抗CD20人源化单克隆抗体的精确分子量及主要的翻译后修饰种类。_LC／MS在抗体轻、重链水平上分析重组抗CD20人源化单克隆抗体轻、重链的精确分子量及主要的翻译后修饰种类。_LC／MS分析重组抗CD20人源化单克隆抗体的质量肽图谱，对其一级结构进行匹配，标定糖丛化位点，并确认抗体的_li要翻译后修饰类型。●LC／MS分析重组抗CD20人源化单克降抗体的糖基化修饰类型，对游离寡糖进行签定，分析符糖形的比例分布。_体外测定曛组抗CD20人源化执体的AI

4、)cC和CDC效应，fl￡接诱导细胞凋r：的作用以及抗体‘』CD20抗坞i的泉和力。第二军医大学硕士学位论文研究结果：一SDS．PAGE及HPLC．SEC分析结果显示，重组抗CD20人源化单克隆抗体分子量与理论分子量一致；经过PmteinA亲和层析及疏水层析，HPLC纯度可达99％以上，有少量的多聚体存在。_PNGaSeF酶切去除N糖基化修饰后的完整抗体的精确分子量为145424．92Da，与理论分子量一致。●还原状态下，PNGaSeF酶切前后，重链的精确分子量分别为50671．28Da和49226．75Da，轻链分子量均为23489．18Da，证实轻链不

5、存在N糖基化的翻译后修饰，重链则存在N糖基化修饰。·LC—MS质量肽图谱分析结果显示，一级覆盖率为loo％，MSE二级覆盖率为96．7％(b，y>3)，一级结构与理论序列完全一致。糖基化位点位于重链第301位的Asn。·正相超高效液相色谱质谱(NP—UPLC．MS)分析共发现并确认的糖形为32种，以二天线复杂型糖形为主，有少量高甘露糖形，以及少量去岩藻糖化糖形，其中G0和GOF的比例分别为6．54％和45．96％。■在体外功能分析结果显示，重组抗CD20人源化单克降抗体的ADCC、CDC、直接诱导细胞凋亡的作用和亲和力均优于鼬tuXimab。关键词：CD2

6、0，人源化抗体，糖肇化，液质联用2AbstractPu印OseNon·Hod北in’slymphomas(NHL)isthemostcommonmalignantt啪orwhichoriginates1nIymphatlcsystem·About85％ofNon—Hod吐in’slymphomasariseinB．cells．111eCD20antlgen1spresentonmoI．ethan95％ofB—celllymphomasandisneithershednorIntemalizedmeraJltibodybinding，makingitane艉

7、ctiveta唱etforimmuIlotherapeuticre】眦’ValofmalignantBcells．Themouse／humanchimericanti．CD20antibodvC288(Rituximab)isthefirstthe唧’euticmonoclonalantibodyapprovedforthen℃atment0fB—cellnon·Hod鲥n’slymphomaS．Despitethee能ctivenessofC288，onlylO％ofpatlentsreSpondtotreatInent聃，hengiVenalone，m

8、Ostpatientsgetreiapsedorre疗actory