两种重组抗CD20人源化单克隆抗体定量分析方法的比较及其在药代动力学研究中的应用.pdf

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1、第42卷分析化学(FENXIHUAX~)研究报告第3期2014年3月ChineseJournalofAnalyticalChemistry337～342DOI：10．3724／SP．J．1096．2014．30623两种重组抗CD20人源化单克隆抗体定量分析方法的比较及其在药代动力学研究中的应用邓承莲2邹佳欧伦2董立厚宋海峰(广西医科大学，南宁530002)(军事医学科学院放射与辐射医学研究所，军事医学科学院药代动力学重点实验室，北京100850)摘要采用酶联免疫吸附分析(ELISA)与基于Wil2一S细胞的流式细胞术(VCA)两种方法对生物基质中的重组抗CD

2、20人源化单克隆抗体(rh—anti．CD20zumab)进行定量分析，并对两种方法进行系统比较。方法学验证结果表明，两种方法均具有良好的特异性、精密度和准确度，但定量范围存在明显差异。ELISA法批内和批间精密度均小于19．5％，准确度为一18．2％一17．6％；FCA法批内和批间精密度均小于19．O％，准确度为一18．9％一18．4％。二者定量范围分别为0．04—5．0mg／L和3．1～200mg／L，ELISA法的灵敏度显著高于FCA法。利用两种方法测定猕猴静脉滴注rh-anti—CD2Ozumab后的血药浓度一时间变化并进行药代动力学(PK)分析。结果

3、表明，在给定剂量下，通过两种方法获得的PK结果具有良好的一致性。FCA法是一种细胞表面抗原靶向性抗体类药物PK研究及药效动力学(PD)研究的快捷、理想的方法。关键词抗CD20单克隆抗体；人源化；ELISA；流式细胞术；药代动力学1引言近年来，随着抗体药物应用的迅猛发展，该类药物的药代动力学(Pharmacokinetics，PK)与毒代动力学(Toxicokinetics，TK)研究成为一大热点。目前，在抗体的PK研究中，定量分析方法主要依赖基于免疫微孔板的配体结合分析(Ligandbindingassays，LBA)方法，如酶联免疫吸附分析(Enzyme．1

4、inkedimmu—nosorbentassay，ELISA)、放射免疫分析(Radioimmun0assay，RIA)等．2j。此外，基于免疫相关技术的表面等离子谐振(Surfaceplasmonresonance，SPR)，Gyros，电化学发光(E1ectr0chemiluminescence，ECL)，6等定量分析方法也在快速发展。在免疫分析方法中，通常需要精制的抗原以及特异性的单克隆抗体用于生物基质中被分析物的捕获与检测。但面对各种层出不穷的新型抗体药物，商品化的特异性单抗极少。因此，制备靶抗原、特异性抗体或抗独特型(Idiotype，ID)抗体，往

5、往成为生物分析方法建立乃至整个PK／TK研究的瓶颈。在此情况下，不依赖于精制抗原或特异性抗体的分析方法如流式细胞术(Flowcytometryassay，FCA)、液相色谱一质谱联用等方法有望大大加快抗体药物的研发进程。但这些方法的适用性及通用性尚有待于进一步考证。本研究建立了基于FCA的抗体药物定量分析方法，并对其方法学以及在PK研究中的应用进行了考察。同时，对FCA法与经典的ELISA法进行了系统的比较。试图对FCA法定量分析抗体药物的方法提供较全面的评估，为后续该类药物的研究提供实验依据。本研究选用重组抗CD20人源化单克隆抗体(rh．anti—CD20

6、zumab)作为目标药物。它是基于人．鼠嵌合型单克隆抗体利妥昔单抗(Rituximab)的结构进行人源化改造而成，其CDR区与利妥昔单抗一致。针对该抗体，以抗利妥昔单抗的抗ID抗体作为捕获抗体(此抗ID抗体靶点为rh．anti．CD20zumab的CDR段)，建立了灵敏高效的夹心ELISA法；同时，建立了基于B淋巴细胞表面抗原竞争的FCA法。在对两种方法分别进行了全面验证之后，利用两种方法同时对猕猴静脉滴注rh．anti—CD20zumab(30mg／kg)后的药代动力学生物样品进行了分析。试图研究和对比不同分析方法测得的药物PK行为的异同，为抗体药物PK的深

7、人研究奠定基础。2013-07-01收稿；2013—11-10接受本研究系国家“重大新药创制”科技重大专项十一五、十二五“I临床前药代动力学技术平台”基金(No．2oo9zx093o4．D04，2012ZX09301003-001．007)资助项目}E-mail：Songhf@vip．163．con338分析化学第42卷2实验部分2．1仪器与试剂Guava微毛细管分析仪(EasyeyteHT，美国Millipore公司)；超纯水系统(美国Millipore公司)；ZW—A微量振荡器(国华电器有限公司)；超净工作台(东联哈尔仪器制造有限公司)；微量加样器(德国B

8、rand公司)；4MK2洗板机(美国T