两种基于raji细胞的抗cd20单抗新型定量方法的比较及在药物代谢动力学中的应用

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1、两种基于RAJI细胞的抗CD20单抗新型定量方法的比较及在药物代谢动力学中的应用作者：董增祥王清清陈立慧侯盛董立厚王诗鸿欧伦刘秀文宋海峰【摘要】建立和比较基于RAJI细胞的流式细胞法(Flowcytometryassay，FCA)和细胞放射免疫法(Immunoradiametricassay，IRA)测定重组抗CD20人源化单克隆抗体(rantiCD20zumAb)的浓度。两种方法均利用标记后抗体和被检测抗体竞争性结合RAJI细胞表面的CD20抗原，由标记后抗体的荧光或放射性变化而间接反应检测抗体的浓度。FCA和IRA定量范围分别为0.1～100mg/L和0.04～2

2、0mg/L，FCA的日内及日间精密度分别小于4.0%和3.0%，准确度为-1.7%～1.1%，IRA的日内及日间精密度值均小于7.0%，准确度为-8.9%～13.2%。方法学确证研究表明，两种方法均具有良好的特异性、灵敏度、精密度和准确度。血浆样品分析结果显示，两种方法具有良好的一致性，是检测猕猴血浆中人源化单克隆抗体浓度的理想方法。【关键词】重组抗CD20人源化单克隆抗体，流式细胞法，放射免疫法，药物代谢1引言13　　CD20抗原(人B淋巴细胞限制性分化抗原)是一种疏水性跨膜蛋白，分子量约为35kDa，表达于前B细胞和成熟B细胞上，在90%以上的非霍奇金氏淋巴瘤(N

3、HL)的B细胞上也有表达[1,2]。但是在造血干细胞、原B细胞、正常浆细胞或其它正常组织未发现表达。CD20抗原不从细胞表面脱落，且与抗体结合后不发生内化，循环中未发现游离CD20抗原，CD20可作为靶位点与抗体结合用于治疗肿瘤[3～5]。重组抗CD20人源化单克隆抗体(rhantiCD20zumab，RACD20)是一个靶向CD20抗原，由人鼠嵌合抗体人源化改造而来，与抗CD20嵌合抗体——美罗华(RituximAb)相似，通过多种机制产生杀伤肿瘤细胞作用。其一是直接作用，包括补体依赖的细胞毒作用(CDC)和抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC);其二是间接作用

4、，包括促进细胞结构改变、诱导调亡和提高细胞对细胞毒性药物的敏感性等[6～8]。该抗原主要适用于非霍奇金氏淋巴瘤。RACD20有效作用的发挥依赖于它能够到达肿瘤细胞的多少，因此准确测定静脉滴注RACD20后病人血中的药物浓度，对于制订合理的给药方案具有一定的指导意义。目前，测定RA13CD20的方法很少，主要针对RituximAb采用的是酶联免疫吸附测定法(ELISA)[9～11]，但是由于没有商品化的试剂盒，在采用ELISA时需要合成较多试剂，操作过程复杂、费时、费力。基于细胞表面抗原来定量检测生物基质中的抗体具有一定的优势：可以针对抗体药物选择含有特定抗原的细胞从而

5、提高特异性;可以在定量分析的同时进行定性的机制分析，而且分析过程操做简单、快速、准确。本研究采用细胞表面表达大量CD20抗原的RAJI细胞[12]，建立了基于RAJI细胞的RACD20的流式细胞法和放射免疫法，利用标记后RACD20和被检测RACD20竞争性结合RAJI细胞表面的CD20抗原，由标记后抗体的荧光或放射性变化而间接反应被检测抗体的浓度。分别进行了两种方法的方法学确证，并比较了两种方法在方法学及测定猕猴血浆样品上的优缺点。　　2实验部分　　2.1仪器与试剂　　流式细胞仪(美国BectonDickinson公司);Wallac1470γ计数仪(美国Perki

6、nElmerTM公司);HP1100四元泵液相系统(美国Agilent公司);RadiomaticTM525TR型流式液闪仪(美国Packard公司);Heraeus培养箱(上海贺利氏公司);超纯水系统(美国MILLIPORE公司);TLLC高速台式离心机(北京四环仪器厂);微量振荡器(国华电器有限公司);微量加样器(美国Gilson公司)。　　RACD20(纯度>98.0%，上海中信国健药业有限公司);异硫氰酸荧光素(FITC，上海中信国健药业有限公司);Na125I(PerkinElmerTM公司)，放化纯度为99.0%，放射核素纯度为99.9%，比放射活度为

7、643.8GBq/mgIodide;Iodogen试剂，即1,3,4,6四氯133α,6α二苯基脲(美国Sigma公司);125I标记的RACD20(纯度>98.0%，自制);RAJI细胞(上海中信国健药业有限公司)。实验用水为二次蒸馏水。　　猕猴血浆样品的采集：每组健康雌性猕猴2只，健康雄性猕猴1只，RACD2010mg/kg于0.5h内在猕猴后肢外侧静脉滴注完毕，于给药前和给药药后30min，1，2，4，8，12，24，36h，2，3，4，5，6，7，8，9，10d在注射对侧后肢静脉取血0.8m