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《新型抗ige人源化单克隆抗体的结构与功能研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、新型抗IgE人源化单克隆抗体的结构与功能研究钱卫珠【摘要】：研究目的:I型超敏反应又称过敏反应,主要由特异性IgE抗体所介导,由于IgE处于变态反应炎症级联反应的最上游,在变态反应启动和发生过程中发挥着关键作用。1987年,首次提出应用抗IgE抗体治疗IgE介导的过敏性疾病,并描述了具有特异性结合能力的抗IgE单克隆抗体。1993年,Kolbinger等报道了一株鼠源性单抗(MaE11)的人源化过程,该抗体又称为Omalizumab或Xolair,包括大约5%的鼠源和95%的人源序列。2003年6月,
2、美国FDA批准Xolair上市。上市伊始,2004年在美国的销售额即达到1.4亿美元,显示出良好的市场前景。然而Xolair抗体与IgE的亲和常数则仅有26nM左右,当抗IgE抗体的治疗浓度达到IgE基础水平的100倍时,才可结合99%的IgE分子,从而充分抑制IgE分子与FcεR相结合。在过敏性哮喘患者体内,游离IgE水平可升高数倍,Xolair抗体的临床用量需要根据IgE的基础水平进行调整,往往需要数百毫克才能达到治疗效果。因此,Xolair的治疗费用十分昂贵,即使在美国也受到医疗保险的限制,目前
3、仅用于吸入激素无法控制的严重病例。国外也有其它医药公司研制了抗IgE的人源化抗体(瑞士Novartis、美国Tanox公司),但由于其临床疗效尚不及Xolair,均于1996年终止了临床试验。本研究利用哺乳动物表达系统,制备了含有关键的功能表位的IgE片段(Fcε2-4),通过杂交瘤技术制备新型的高亲和力抗IgE单克隆抗体,筛选具有竞争抑制IgE与其受体FcεR结合功能的克隆。为降低鼠源单抗的免疫原性,对筛选获得的抗体进行人源化改造,比较制备所获抗体及Xolair与IgE结合的亲和力及体外功能,以期从
4、结构上阐明该抗体的作用机制。通过该课题的研究,以期获得亲和力更高的、可望用于过敏性疾病预防和治疗的新型抗IgE人源化单克隆抗体。研究方法:本课题采用小鼠杂交瘤技术,利用IgEFcε2-4作为免疫原,免疫获得具有竞争抑制IgE与FcεR结合功能的鼠源单克隆抗体。为进一步降低单抗的免疫原性,减轻用于人体时的HAMA反应,提高安全性,我们采用计算机辅助设计模拟抗体空间构象的方法,对鼠源抗体进行了人源化改造,对改造成功的人源化单克隆抗体体外功能进行了详细分析,并与Omalizumab的体外功能进行比较。我们应
5、用噬菌体随机七肽库对人源化单克隆抗体的抗原表位进行亲和淘选,从而明确抗体识别的表位,通过分析IgE与其高亲和力受体FcεRIα的复合物结晶,与抗IgE抗体所识别表位进行比较,从空间结构上解释和阐明抗IgE人源化单克隆抗体的功能学基础。结果:获得哺乳动物细胞表达的IgEFcε2-4以及FcεRIA,通过杂交瘤技术筛选获得具有竞争抑制IgE与FcεR结合的鼠源抗IgE单克隆抗体7A5。利用计算机辅助设计的手段,改造获得亲和力和特异性均较好的人源化抗IgE体Hu7A5m18。体外功能分析结果表明:Hu7A5
6、m18可抑制IgE与可溶性及细胞表面FcεRI结合,而对结合于细胞表面FcεRI的IgE则无影响,Hu7A5m18可以抑制IgE与细胞表面FcεRI结合导致的脱颗粒反应。Hu7A5m18介导上述体外功能的EC50仅为Omalizumab的1/10左右。SPR技术检测M7A5、Hu7A5m18及Omalizumab与IgE的亲和力分别为1.9nM、1.7nM和23.8nM,因此Hu7A5m18人源化改造成功,而且该单抗的亲和力明显高于Omalizumab。我们应用噬菌体随机七肽库对Hu7A5m18的抗原
7、表位进行亲和淘选,通过对阳性噬菌体序列的分析比对,发现一个非常保守的序列被高度扩增,而这个序列与IgE恒定区Cε3片段内的391KQR393高度同源。通过分析IgE与其高亲和力受体FcεRIα的复合物结晶,发现IgE恒定区Cε3片段内的391KQR393序列在空间上临近IgE高亲和力受体FcεRIα在IgE分子上的结合位点,从而推论正是由于这种结合位点上的空间位置,使Hu7A5m18可以通过空间位阻抑制IgE分子同高亲和力受体FcεRIα结合。我们前期的研究结果显示,Omalizumab识别表位定位于
8、IgE-FcCε3的424HLP426,该序列与高亲和力IgE受体结合位点重叠。由于Hu7A5m18识别表位391KQR393在空间上与Omalizumab识别表位424HLP426也临近,这也正是Hu7A5m18能够与Omalizumab竞争结合IgE的结构原因。结论:本研究制备的新型抗IgE人源化单克隆抗体,具有更好的亲和力以及体外功能,可望解决目前临床应用的IgE抗体活性不高,用量过大的瓶颈,成为过敏性疾病预防和治疗的候选药物。表位淘选获得该抗体识
