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1、人促红细胞生成素在CHO细胞上的表达魏霄雲哈尔滨师范大学生命科学与技术学院生物制药促红细胞生成素的理化性质EPO是由165个氨基酸组成的高糖基化蛋白质，去唾液酸或去糖基化不影响重组人EPO的体外生物活性，但却缩短了在体内的半衰期，使其完全丧失了在体内的活性，说明糖基对其生物活性是至关重要的，因此基因工程的EPO不能利用原核表达系统，只能利用哺乳动物细胞表达系统（如CHO细胞）生产关于EPO人促红细胞生成素是一种由肾脏产生的高度糖基化蛋白,是红系细胞发育过程中最重要的调节因子。天然存在的EPO药源极为匮乏,须
2、从贫血病人尿中提取,不能满足社会的需要。1985年Jacob等成功地从胎儿肝中克隆出EPO基因,使通过基因工程手段大量生产重组EPO成为可能。关于EPO国外用人促红细胞生成素gDNA(genomicDNA)在哺乳动物细胞中已获得高效表达,而在我国虽也有重组产品问世,但存在表达水平偏低,生产成本偏高的问题,不能满足大规模工厂化生产和临床应用的需要,因此迫切需要提高EPO在细胞中的表达量。为此,我们开展了EPO在CHO细胞中的表达研究,希望能获得比较理想的效果。实验目的：获得人促红细胞生成素(EPO)的高效表达
3、三、实验仪器及耗材实验试剂与器材氨甲喋呤(MTX)、煌焦油蓝购于Sigma公司;rHuEPO体内生物学活性测试工作标准品为Amgen公司产品;Lipofectamine、犊牛血清、F12与D-MEM细胞培养基购自Gibco/BRL公司;EPOELISAkit购自BoehringerMannheim公司;96孔与24孔细胞培养板为Costar产品。三、实验仪器及耗材实验材料菌株DH5α,JM109均由本实验室保存。质粒 质粒pD、p38(内含EPOgDNA)由本实验室保存,pcDNA3购自Invitrogen
4、公司,pSV40dhfr由PaulBerg实验室构建,本实验室保存。工具酶 各种限制性内切酶均购自华美生物工程公司,T4DNA连接酶与牛小肠碱性磷酸酶购自Gibco/BRL公司,DNA聚合酶I大片段(Klenow)购自Promega公司三、实验仪器及耗材细胞株CHO-dhfr-细胞由本室保存。实验动物雌性BALB/c小鼠,6~8周龄。方法以EPOgDNA为基础构建了两个真核表达载体pDE、pCE,将它们分别经脂质体转染CHO-dhfr-细胞,其48h瞬时表达量分别为27·5ng/ml与88·90ng/ml。
5、然后用氨甲喋呤(MTX)对转染细胞进行加压并挑选细胞克隆,共获得3株高效表达EPO的工程细胞株A,B,C,其中A来自质粒pCE,B和C来自pDE,在2×10-6mol/L的MTX的压力下,它们48h的最高表达水平分别为A:8·7μg/mlB:10·76μg/ml,C:16·44μg/ml。经网织红细胞法测得它们均具有体内生物活性。网织红细胞计数(一)原理网织红细胞是晚幼红细胞脱核后但尚未完全成熟的红细胞,胞质中尚有核糖体、核糖核酸等嗜碱性物质残存,经煌焦油蓝或新亚甲蓝活体染包后,胞质中可见蓝或蓝绿色枝点状甚
6、至网织状结构。(二)方法活体染色法.近年来还可通过某些血液自动分析仪及流式细胞术检测法进行网织红细胞计数。四·实验步骤质粒的转化、酶切、去磷、连接、重组子质粒的鉴定等基因操作细胞的转染按lipofectamine使用说明书进行,在此过程中质粒要经特定的内切酶线性化,在pCE中采用BglⅡ,pDE则采用EcoRⅠ,其中质粒pCE要与经EcoRⅠ线性化的质粒pSV40-dhfr共转染。细胞克隆的筛选CHO-dhfr-细胞在转染质粒48h后,经胰蛋白酶消化后进行细胞计数,用F12培养液将其稀释成1×104cell
7、s/ml,置37℃CO2培养箱中培养,当细胞形态恢复正常后,换用D-MEM培养液置CO2培养箱中继续培养,约15d后出现肉眼可实验步骤见的细胞克隆此时可用弯头吸管挑取细胞克隆至96孔细胞培养板中培养,同时在培养液中添加MTX,其初浓度为1×10-8mol/L,以每10d为一个周期,倍比地提高MTX的浓度。在适当的时候将96孔板内的细胞转入24孔细胞培养板中,然后再转入30ml细胞培养瓶中培养,至此细胞克隆工作即告完成。在挑选克隆的过程中,应挑取加压后表达水平提高较明显的细胞株,而非一开始表达量较高的细胞。细
8、胞表达上清中EPO含量的检测采用BoehringerMannheim公司的EPOELISAkitEPO生物活性的测定采用网织红细胞计数法五·实验结果1·真核表达载体pDE、pCE的构建将质粒p38经SalⅠ酶切后,回收长为2·4kb的EPOgDNA片段,除EPO蛋白编码区外,其5’非翻译区长120bp,3’非翻译区长200bp。同时将真核表达载体pD、pcDNA3分别用SalⅠ、HindⅢ线性化,线性化的pD经C
