高质量匍枝根霉cDNA文库的构建及鉴定-论文.pdf

《高质量匍枝根霉cDNA文库的构建及鉴定-论文.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、第29卷第2期安徽工程大学学报Vo1．29．NO．22014年6月JournalofAnhuiPolytechnicUniversityJun．，2014文章编号：16722—477(2014)02—0035—04高质量匍枝根霉cDNA文库的构建及鉴定李祥林，汤斌，李松(安徽工程大学微生物发酵安徽省工程技术研究中心，安徽芜湖241000)摘要：从匍枝根霉总RNA出发纯化获得mRNA，经逆转录酶作用合成eDNA，构建高质量的cDNA文库，为快速筛选和研究匍枝根霉相关关键基因提供了基础．研究采用CHROMSPIN柱回收大于500bp的e

2、DNA并连接pUCm-T载体，成功构建了匍枝根霉cDNA文库．鉴定结果显示：文库库容为1．95X10。cfu，文库滴度为7．84×10cfu／mL，该文库中cDNA片段大小分布在500~4000bp，文库重组率为96．关键词：匍枝根霉；cDNA文库；鉴定中图分类号：Q93文献标识码：A匍枝根霉TP一02是一株具有高效降解纤维素能力的接合菌门匍枝根霉亚种[1]．目前，国内对匍枝根霉的研究主要集中在纤维素酶E、脂肪脱氢酶[3]、木聚糖酶[4等方面．本实验室已从匍枝根霉菌株中成功分离筛选获得3个内切葡聚糖苷酶]基因和2个f}-葡萄糖苷酶[

3、6基因．该菌株与工业菌株里氏木霉降解纤维素的能力相比，具有发酵周期短、酶活力高等优点[7]．建立DNA文库可有效获取或筛选目的基因L8]，为了进一步丰富和健全匍枝根霉的纤维素酶酶系基因，构建高质量匍枝根霉eDNA文库具有重要意义．本文拟从匍枝根霉菌株中提取总RNA，分离纯化获得mRNA，连接pUCm-T载体，导人大肠杆菌DH5a，构建cDNA文库．通过菌落计数、蓝白斑筛选对文库库容和滴度、文库重组率及插入片段大小进行鉴定，并对文库质量进行分析，从而构建高质量eDNA文库，为纤维素降解过程中关键基因的筛选提供基础．1材料和方法1．1实

4、验材料(1)菌株、载体和培养基．本研究中匍枝根霉菌株，大肠杆菌DH5a、pUCm—T载体均保管于安徽工程大学3R实验室．PDA培养基(g／L)：马铃薯200g，葡萄糖20g，pH自然．LB培养基(g／L)：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠log．根霉发酵培养基：发酵培养基：2不同颗粒度的玉米秸秆、稻草与麦秆，5麸皮浸出汁，(NH)2SO3，KH2PO1％，MgSO·7H2O1％，CaC122，Tween800．025oA，微量元素液等均参照文献[9]配制．(2)主要试剂．Trizol提取试剂盒、mRNA纯化试剂盒，柱式PCR产物纯化

5、试剂盒，质粒DNA小量抽提试剂盒等，均购自上海生工．Taq酶，M—MLVRTasecDNASynthesisKit、T4DNA连接酶购自宝生物(3v连)有限公司．1．2实验方法(1)匍枝根霉总RNA的提取．将匍枝根霉菌株接种到PDA斜面培养基培养3～5d，转接到液体PDA种子液中培养24h，8接种于CMC-Na诱导培养基培养60h，此时，菌体处于生长对数期，体内所含基因丰富，为构建eDNA文库提供了基础．过滤收集新鲜菌体，无菌水洗涤数次，冷冻干燥．取1g菌丝体液氮充分研磨．Trizol法提取总RNA，并用0．8％的琼脂糖凝胶电泳检测

6、．(2)mRNA的分离纯化．用Oligo(dT)Cellulose对总RNA进行分离纯化，提取mRNA．具体步骤参照试剂盒说明书进行．(3)cDNA双链的合成及修饰．取1g纯化的mRMA，在逆转录酶的作用下合成cDNA第一条链，使用E．coliRNaseH使DNA—RNA杂合体的RNA链产生缺口，在E．coliPolymeraseI与E．coliDNA收稿日期：2014—01—03基金项目：国家自然科学基金资助项目(31270315)作者简介：李祥林(1989一)，男，安徽庐江人，硕士研究生．通讯作者：汤斌(1954一)，男，安徽桐

7、城人，教授，硕导．安徽工程大学学报第29卷Ligase的作用下，合成eDNA第二条链．使用0．8％琼脂糖凝胶电泳检测．(4)eDNA初级文库的建立．将eDNA双链用T4DNALigase与pUCm-T连接，电转化到宿主菌DH5a感受态中，得到匍枝根霉cDNA原始文库，4℃保存．(5)cDNA文库的质量鉴定．取2LeDNA文库细菌培养液按1：1000梯度稀释，均匀涂布于含氨苄青霉素(100t~g／mL)、IPTG(O．1t~mol／mL)和X-gal(20t．tg／mL)的LB平板上37℃正置1h充分吸收后，倒置培养12~16h．根据

8、菌落计数法统计文库库容及滴度．文库库容(cfu)一菌落数×转化细胞总体积×吸湿率X10ooo／涂布菌体体积(L)，文库滴度(cfu／mL)=菌落数×稀释倍数×1ooo／所涂布菌体体积(L)．根据蓝白斑数量比例来确定重组率．重组率=白斑