人正常胃黏膜细胞全长cdna文库的构建及鉴定

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1、人正常胃黏膜细胞全长cDNA文库的构建及鉴定【摘要】目的构建人正常胃黏膜细胞的cDNA文库并鉴定文库质量。方法运用mRNA5′末端的模板转换方法以powerscript逆转录酶进行转录,在mRNA的5′末端添加一段5′oligo做为延伸后的模板,从而富集全长cDNA.扩增后的cDNAs经XhoI酶切、柱层析洗脱,重组于pGADT7载体并包装后,测定滴度、重组率,扩增文库。随机挑取16个克隆行PCR反应扩增插入片段。结果构建的cDNA文库滴度为4.00×106pfu/ml,重组率>95%,扩增后滴度达9.50×109pfu/ml,

2、16个插入片段长度为0.5～2.0kb.结论构建的人正常胃黏膜细胞cDNA文库为高效全长的酵母双杂交cDNA文库,符合cDNA文库的要求,可进一步用酵母双杂交的方法探寻与胃疾病相关的基因。【关键词】胃黏膜细胞;cDNA文库;全长　　【Abstract】ObjectiveToconstructafulllengthcDNAlibraryofhumangastricmucosaandidentifythequalityofthelibrary.MethodsThelibrarywasconstructedbyusingthetempla

3、teswitchingtechniqueat5′endofmRNA.Apowerscriptreversetranscriptasewasusedtotranscribe,anda5′oligofragmentasanextendedtemplatewasaddedto5′endofmRNAtoenrichfulllengthcDNAs.Afteramplification,thecDNAs11digestedbyXhoIandsizefractionatedbycolumnswererecombinedintopGADT7ve

4、ctors.Afterpackage,thetiterofrecombinantvectorsandtherecombinantrate(blue/white)weredetermined,thenthelibrarywasamplified.WeidentifiedthelibraryusingPCRreactiontodeterminethesizeoftheinserts.ResultsThetiterofcDNAlibrarywas4.00×106pfu/ml,therateofrecombinantwasabove95%,a

5、ndthetiterofamplifiedlibrarywas9.50×109pfu/ml.Theinsertsizerangedfrom0.5to2.0kb.ConclusionTheyeasttwohybridcDNAlibraryofhumangastricmucosaissuccessfullyconstructedandcanbeusedforscreeningbyYeastTwoHyBridtofindthegenesrelatedtogastricdiseases.　　【Keywords】gastricmucosa;

6、cDNAlibrary;fulllength　　随着人类基因组计划的初步完成,确定不同发育阶段的功能基因成为后基因组时代的重要研究内容,而构建cDNA文库已成为研究功能基因组学的基本手段之一,在分离、克隆、筛选新基因以及基因功能研究等方面具有重要作用[1]。本研究以pGADT7为表达载体,构建了一个人正常胃黏膜细胞全长cDNA表达文库,为今后胃疾病相关基因的研究工作奠定了基础。11　　1材料与方法　　1.1材料　　人GES1细胞于2009年6月18日购自中南大学湘雅中心实验室。Trizol提取试剂购自美国Invitrogen公司;

7、质粒小量提取试剂盒、PCRTaqMix试剂盒、OligotexdT30mRNAPurificationkit购自大连宝生物科技有限公司;其他生化试剂购自国内生物公司。　　1.2方法　　1.2.1总RNA提取及poly(A)+RNA纯化细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基,在37℃,5%CO2的条件下培养。培养至旺盛生长期,倾尽培养液后直接向培养瓶中加入Trizol试剂(1ml/10cm2),裂解细胞,并用吸头将细胞裂解物吹吸几次,再经氯仿抽提及异丙醇沉淀后,以75%乙醇洗涤,室温自然干燥,干燥后溶于三蒸水中(DECP处理),并在5

8、5～60℃放置10min让其充分溶解。取出一小份稀释后在紫外分光光度计下测RNA含量及纯度,并做琼脂糖凝胶电泳分析总RNA完整性。以OligotexdT30mRNAPurificationkit进行mRNA分离纯化,实