smart技术构建红曲霉全长cdna文库论文

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1、SMART技术构建红曲霉全长cDNA文库论文.freelechanismat5′endofRNAtranscript)技术构建红曲霉全长cDNA文库，经涂平板和酶切反应测定文库的克隆数、重组率，PCR测定插入片断的大小。结果原始文库的库容为2.03×105，重组率达94%。插入片段大小多在0.7～2.0kb.freeletabolitesinMonascus.MethodsAcDNAlibrary.Thenumberoftheclonesandtherebinationrateofthelibraryinedbyplatecoatingandrestrictivedigestion,and

2、thesizeofinsertedfragmentinedbyPCR.ResultsTheprimarylibrarycapacityentsizeettherequirementforcloningtargetgenesandexpressingtargetproteins.Keyin，培养5d至产生红曲色素。将菌液离心，沉淀分别用蒸馏水、无菌水、DEPC水润洗，干燥，称干重，将样品放于研钵中，加入液氮，研磨至粉状。在样品未融化前加入Trizolreagent，继续研磨使样品溶解。离心，取上清。加氯仿，摇匀，离心，取上清。加异丙醇沉淀RNA。75%(φ)乙醇洗涤沉淀，风干RNA，用无RN

3、ase水溶解沉淀，-70℃保存。得总RNA。使用紫外分析仪检测总RNA浓度、纯度，1.1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。1.2.2双链cDNA的合成广东药学院学报第25卷第3期朱碧云，等.SMART技术构建红曲霉全长cDNA文库在5μL反应体系中加入1.0μgtotalRNA、SMARTⅣOligonucleotide(5′AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG3′)1μL、CDSⅢ/3′PCR引物5′ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGd(T)30N-1N3′(N=A、G、CorT;N-1=A、GorC1μL，用无RNas

4、e水补足到5μL。混匀，短暂离心，72℃，2min;冰上冷却2min，短暂离心;向反应液中加入5×第一链反应缓冲液2.0μL及20mmol/LDTT、10mmol/LdNTP混合液、MMLV逆转录酶各1μL于42℃孵育60min，置于冰浴中终止反应。取2μL第一链产物于干净预冷0.2mL反应管中，进行PCR扩增。引物为5′PCR引物(5′AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT3′)、CDSⅢ/3′PCR引物。循环条件为：首先把PCR仪预热到95℃，再20个循环：95℃15s，68℃6min。1.1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并估算其浓度。1.2.3cDNA的分级分离纯化及文

5、库构建合成的双链cDNA经蛋白酶K消化及SfiⅠ酶切后，柱层析分级，共收集15管，每管取3μL进行1.1%琼脂糖电泳检测，合并能显示亮带的前4管(片段0.4kb)，进行沉淀，重悬在去离子水中，加T4DNA连接酶，与质粒载体pDNRLIB(经SfiⅠ酶处理过)于16℃下连接过夜。cDNA与载体的比例为1.5∶1。连接产物经电击转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。电击条件：电击杯内径0.1cm，电容25μF，电阻200Ω，电压1.8kV，感受态25μL,电转仪：BIORADGenePulserXcell电穿孔仪。将转化产物转移到加有1mLLB培养基的试管中，225r/min，37℃，培养1h。

6、1.2.4原始文库质量鉴定取适量原始文库菌液，均匀地涂在含30μg/mL氯霉素的LB平板上，随机挑取15个克隆，提取质粒经SfiⅠ酶切后电泳检测，可测定其重组率及重组片段的大小。文库的扩增采用涂平板培养扩增。取适量原始文库均匀地涂在10个含30μg/mL氯霉素的LB平板，37℃倒置培养过夜，用含有25%(φ)甘油LB培养基洗脱所有的菌落，2mL/板，将每板的洗脱液混合摇匀即得到了扩增文库，检测其滴度，分装，放置-80℃保存。2结果分析2.1总RNA提取提取的样品总RNA经紫外分光光度计测定，A260/A280值为1.77，表明所得总RNA纯度较高，但稍有降解。1.1%琼脂糖凝胶电泳结果显示

7、(图1)，28SrRNA、18SrRNA和5.8SrRNA三条特征条带清晰，表明总RNA比较完整，也没有明显的基因组DNA污染。2.2双链cDNA的合成及分级合成的双链cDNA产物的1.1%琼脂糖凝胶电泳结果显示，成一弥散带，最大片段超过10kb，主要集中在0.5～2.5kb(图2)，表明合成的cDNA是比较完整的。由于较小的非全长cDNA片断更容易连接进载体，所以需要对经过蛋白酶K处理和SfiⅠ酶切后的cDNA进行分级