smart 技术构建肾乳头状腺癌及癌旁组织的cdna文库论文

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1、SMART技术构建肾乳头状腺癌及癌旁组织的cDNA文库论文成瑜李旭陈葳杨玉琮【关键词】肾肿瘤ConstructionofcDNAlibrariesofrenalpapillaryadenocarcinomatissueanditssidetissueatissueanditssidetissuebySMARTtechnology.METHODS:Sechanismat5′endofmRNAtemplatetechnology,SMARTtechnology,plate,PoplateRNAtoe

2、nrichthefulllengthcDNAs.Afteramplification,thedscDNAns(CHROMASPIN400)andthenrebinedtotheλTripIEx2vector.Afterpackage,thelibrariesinedandthenthecDNAlibrariesplified.RESULTS:ThetiterofthecDNAlibrariesofrenalpapillaryadenocarcinomatissueanditssidetissue

3、L-1and2.6×106pfumL-1,respectively.Afteramplification,theratesincreasedto6×1011pfumL-1and9×1011pfumL-1,respectively.CONCLUSION:OursuccessfullyconstructedcDNAlibrariesarefulllengthlibrariesa.【Keys;cDNAlibrary;SMART【摘要】目的：运用SMART技术构建肾乳头状腺癌及癌旁组织的cDNA文库.方

4、法：运用mRNA5′末端的模板转换方法，即SMART技术，以纯化的Poly(A)+RNA为模板，用PoRNA的5′末端添加一段5′oligo作为延伸后的模板，从而富集全长cDNA.cDNA扩增后，经sfiI酶切、CHROMASPIN400洗脱，与λTripIEx2载体连接并用载体蛋白包装后.freelL-1和2.6×106pfumL-1，重组率均98%，扩增后滴度分别达6×1011pfumL-1和9×1011pfumL-1.结论：我们构建的人肾乳头状腺癌及癌旁组织cDNA文库为高效、全长cDNA

5、文库，可以用做探针、抗体等免疫学筛选,进一步探寻与肾乳头状腺癌相关的基因.【关键词】肾肿瘤；cDNA文库;SMART技术0引言肾癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，生物学行为极为多变，其发病机制及发生发展的分子生物学基础至今不明.鉴于此，我们利用SMART(sechanismat5′endofmRNAtemplate)技术分别构建了肾乳头状腺癌及其癌旁组织的cDNA文库，为肾乳头状腺癌相关基因的研究工作奠定了基础.1材料和方法1.1材料人肾乳头状腺癌和癌旁正常组织(距癌组织1.5cm以上)由西安交

6、通大学第一医院泌尿外科提供.TRIzol试剂购自Gibco公司;SMARTTMcDNAlibraryconstructionkit购自Clontech公司;OligotexTMdT30mRNApurificationkit购自Takara株式会社;载体包装蛋白为Epicentre产品;IPTG,XGal购于Promega公司，其余均为国产分析纯.1.2方法1.2.1总RNA提取及mRNA纯化人肾乳头状腺癌和癌旁组织各0.5g入预冷的匀浆器中，随即加入TRIzol5mL，于冰浴中研磨成匀浆，氯仿异

7、丙醇抽提，750mLL-1乙醇洗涤干燥后溶于200μL无RNase水中［1］.mRNA提取按照OligotexTMdT30mRNApurificationkit操作说明书进行.1.2.2cDNA文库的构建取1.0~1.5μgPoly(A)+RNA，以5′oligo(5′AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG3′)及3′oligo(dT)［5′ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGd(T)30N’N3’,.freelin,95℃20s,随后进

8、行循环:95℃5s，68℃8min，其中肾乳头状腺癌进行4个循环，癌旁组织进行5个循环（PE扩增仪2400型）.PCR反应结束后，反应液经蛋白酶K处理以去除其中的酶类，合成的双链cDNA用sfiI酶切及CHROMASPIN400柱层析洗脱，收集0.5～5.0kb之间的组分，在T4DNA连接酶作用下，将dscDNA与λTripIEx2载体（经sfiI酶处理过）的去磷酸化臂连接，16℃水浴过夜.随后置冰浴中2h，65℃水浴灭活连接酶，于30℃进行包装.1.2.3文库滴定、重组率测定和扩增cDNA文库