人正常胃黏膜细胞全长cdna文库的构建及鉴定

《人正常胃黏膜细胞全长cdna文库的构建及鉴定 》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、人正常胃黏膜细胞全长cDNA文库的构建及鉴定随着人类基因组计划的初步完成,确定不同发育阶段的功能基因成为后基因组时代的重要研究内容,而构建cDNA文库已成为研究功能基因组学的基本手段之一,在分离、克隆、筛选新基因以及基因功能研究等方面具有重要作用[1]。本研究以pGADT7为表达载体,构建了一个人正常胃黏膜细胞全长cDNA表达文库,为今后胃疾病相关基因的研究工作奠定了基础。　　1材料与方法　　1.1材料　　人GES1细胞于2009年6月18日购自中南大学湘雅中心实验室。Trizol提取试剂购自美国I

2、nvitrogen公司;质粒小量提取试剂盒、PCRTaqMix试剂盒、OligotexdT30mRNAPurificationkit购自大连宝生物科技有限公司;其他生化试剂购自国内生物公司。护理论文发表　　1.2方法　　1.2.1总RNA提取及poly(A)+RNA纯化细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基,在37℃,5%CO2的条件下培养。培养至旺盛生长期,倾尽培养液后直接向培养瓶中加入Trizol试剂(1ml/10cm2),裂解细胞,并用吸头将细胞裂解物吹吸几次,再经氯仿抽提及异丙醇沉淀后,以7

3、5%乙醇洗涤,室温自然干燥,干燥后溶于三蒸水中(DECP处理),并在55～60℃放置10min让其充分溶解。取出一小份稀释后在紫外分光光度计下测RNA含量及纯度,并做琼脂糖凝胶电泳分析总RNA完整性。以OligotexdT30mRNAPurificationkit进行mRNA分离纯化,实验步骤按说明书进行。　　1.2.2第一链cDNA的合成将模板RNA(Poly(A)+RNA)5μg中加入H2O,使其总量达到9.8μl,于72℃孵育2min,冰中放置2min后在微量离心管中加入5×1stStrand

4、SynthesisBuffer4μl、1stStranddNTPMixture1.2μl、RNaseInhibitor(20U/μl)1.0μl、1μg/μlOligo(dT)18AnchorPrimer[序列为5'(GA)10ACTAGTCTCGAG(T)18V3'(V:AorCorG)]2.0μl于室温放置10min后加入ReverseTranscriptase(MMLV)1.0μl,轻轻混匀,于42℃孵育60min,向反应管中加入200U/μlSuperScriptIIIRTase1μl

5、,52℃孵育60min,反应结束后置于冰中冷却2～5min.　　1.2.3双链cDNA合成在第一链cDNA合成液(20μl)中加入5×2ndStrandSynthesisBuffer30μl、2ndStranddNTPMixture4.5μl、RNasefreeH2O87.5μl、E.coliRNaseH/E.coliDNALigaseMixture2μl、E.coliDNAPolymeraseⅠ2μl.用移液枪轻轻混匀后,16℃反应2h,70℃加热10min,室温放置5min,加入4μl的T4DN

6、APolymerase轻轻搅拌,37℃反应10min.经PCI抽提、CI抽提后,加入3MSodiumAcetate(pH5.2)15μl,Dr.GenTLEPrecipitationCarrier3μl,100%乙醇400μl,立即进行室温下15000r/min共30min的离心。除去上清后用70%的乙醇清洗,干燥沉淀后,用3.5μl的RNasefreeH2O溶解沉淀。　　1.2.4cDNA与salⅠadaptor的连接向上述双链cDNA溶液3.5μl中加入下列试剂:10×T4DNALigaseBu

7、ffer1μl,0.4μg/μlEcoRIAdaptor3.5μl,350U/μlT4DNALigase1μl,10mmRatp1μl,全量为10μl.轻轻混匀,8℃过夜反应,70℃保温30～45min,室温放置5min.　　1.2.5限制酶XhoI酶切反应向AdaptorLigation溶液中加入:10×Hbuffer5μl,50U/μlXhoI3μl,轻轻混匀,37℃反应3h.护理论文发表　　1.2.6使用SpinColumn除去短链cDNA及文库构建单链(singlestrand,ss)cDNA

8、扩增后合成双链(doublestrand,ds)cDNA,dscDNA经XhoⅠ酶切及柱层析洗脱,收集0.5～5kb之间的组分,在T4DNA连接酶作用下,与pGADT7去磷酸化臂于16℃水浴中过夜连接,随后包装蛋白包装载体。　　1.2.7文库滴定、重组率测定和扩增按照构建的cDNA文库滴度文库滴定公式[2]:原始文库滴度=克隆斑总数×稀释倍数×包装体积,重组率测定采用蓝白斑筛选方法,即向含有酵母菌和E.coli.XL1Blue混合液的上层琼脂中分别加