细粒棘球绦虫成虫全长cdna质粒文库的构建及鉴定

《细粒棘球绦虫成虫全长cdna质粒文库的构建及鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、细粒棘球绦虫成虫全长cDNA质粒文库的构建及鉴定：吕刚，芦亚君，范志刚，史大中，王虎，韩秀【摘要】　　目的：构建细粒棘球绦虫（E.g.）成虫全长cDNA质粒文库，并检测文库质量。方法:提取E.g.成虫mRNA，应用SMART方法构建pBluescriptIISK全长cDNA质粒文库，检测文库的重组率及容量；用载体克隆位点两端的引物进行PCR扩增，检测插入片段大小。随机挑选阳性重组克隆5′端测序，归并unigene，计算unigene得率，全长性判定主要根据同源全长基因5'末端进行比较判定并计算全长率。结果:成功构建E.g.成虫全长cDNA质粒文库。文库的重组率为95.04%，库容量

2、1.13×106；平均插入片段长度约为1.2kb。24个随机阳性克隆测序，unigene比例为69.57%，全长性比率为64.71％。结论:成功构建E.g.成虫全长cDNA质粒文库，文库质量良好。【关键词】细粒棘球绦虫；成虫；全长cDNA质粒文库；构建；鉴定　　［ABSTRACT］Objective:ToconstructandevaluatefullLengthcDNAlibraryofadultEchinococcusgranulosus（E.g.）.Methods:mRNAtheadultE.g.andusedfortheconstructionoffulllengthc

3、DNAlibraryusingSMARTpBluescriptⅡSKkit.Therebinationrateandcapabilityofthelibraryeasuredandthelengthofinsertfractionofthepositiverebinantcloneslyselectedfor5'endsequencingandtheratesofunigene,fulllengthcDNAatics.Results:ThefulllengthcDNAlibrayofadultE.g.lyselectedidlibraryofadultE.g.hasbeenc

4、onstructedsuccessfully.　　［KEYARTIV寡核苷酸，CDSIII/3JPCR引物，pBluescriptIISK的改造载体（将EcoRI和NotI之间的序列改造为SfiIA和SfiIB接头序列），由上海联合基因公司合成和提供；DH5α感受态菌，通用合成引物M13+/M13，异丙基βD硫代半乳糖苷（IPTG）和xgal为上海生工生物工程技术有限公司产品；质粒抽提试剂盒，荷兰QIAGEN公司产品；DYEnamicTMETDYETerminatorKit（MegaBACETM）为美国AmershamBiosciences产品；MilliQ水纯化系统

5、，美国Millipore公司产品；SpectraMaxPlus384连续波长酶标仪，美国MolecularDevices公司产品；FR280电泳仪，上海复日公司产品；HYBAIDPCREXPRESSPCR仪，英国ThermoHybaid公司产品；ABIPRISM3700测序仪，美国PEABI公司产品。　　1.2方法　　1.2.1全长cDNA质粒文库的构建　　1.2.1.1样品总RNA抽提及mRNA纯化　　按提取试剂盒操作说明书抽提总RNA产物，于260nm及280nm测吸光度（A260及A280），计算A260/A280比值判定纯度（纯RNAA260/A280=1.9-2.1），

6、1.1%琼脂糖电泳检测RNA完整性。　　根据QIAGEN公司的OligotexmRNAKits操作说明书进行分离，A260及A280检测及1.1%琼脂糖电泳检测抽提结果。　　1.2.1.2cDNA第一链合成　　0.5mL灭菌离心管中加入以下试剂：2μg样品RNA，1μLSMARTIVOligonucleotide，1μLCDSIII/3'PCRPrimer，加水补足5μL，混匀试剂并稍离心，72℃温浴2min，冰浴2min，稍离心后加入下列试剂：2.0μL5×FirstStrandBuffer，1.0μLDTT(20mmol/L)，1.0μLdNTPMix(10mmol/L)，1

7、.0μLPoer，2μLCDSIII/3'PCRPrimer，2μL50×Advantage2PolymeraseMix，总反应体系100μL。轻拍混匀，稍离心后置于已预热PCR仪，按下面程序开始PCR：95℃1min，26cycles;95℃15sec，68℃6min。循环结束后取5μL样品1.1%琼脂糖电泳检测。　　1.2.1.4PCR产物纯化　　合并LDPCR产物至0.5mL菌离心管中，加入2μL蛋白酶K（20μg/μL），混匀试剂并稍离心，45℃温浴20mi