rmp基因干扰对肝癌细胞周期的影响

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1、中国生物工程杂志ChinaBiotechnology，2011，31(5):8-14*RMP基因干扰对肝癌细胞周期的影响＊＊郭云兰杨慧翠连晓宁曹锴王晓婷仲蕾魏文祥(苏州大学基础医学与生物科学学院苏州215123)摘要目的:建立RMP(RPB5-MediatingProtein)基因干扰的稳定细胞株，研究RMP基因干扰对正常肝细胞及其肝癌细胞周期的影响。方法:构建RMP基因的短发卡RNA(short-hairpinRNA，shRNA)真核表达载体pGPU6-Neo-RMPi-484。通过脂质体转染的方法转染到SMMC-7721肝癌细

2、胞中，G418筛选出干扰RMP基因的细胞株;RT-PCR检测RMP基因的表达;流式细胞仪PI染色检测细胞周期;RT-PCR检测周期相关基因的表达。结果:成功构建pGPU6-Neo-RMPi真核表达载体，筛选出稳定干扰细胞株，并且发现干扰RMP基因能够明显引起SMMC-7721肝癌细胞的G2/M期阻滞。结论:干扰RMP基因引起SMMC-7721肝癌细胞G2/M期阻滞，可能是通过下调G2/M期检验点相关基因CyclinB、P21和CDK1的表达实现的。关键词干扰RMP肝癌细胞细胞周期中图分类号Q789RMP(RPB5-Mediatin

3、gProtein)是RNA聚合酶II基因的短发卡RNA(short-hairpinRNA，shRNA)真核表(RNApolymeraseII，RNAPII)第5亚基RPB5的调节蛋达载体，通过脂质体转染的方法转染到SMMC-7721肝［1］白，RMP最早于1995年由Cheong等采用Far-癌细胞中，采用流式细胞仪PI染色检测细胞周期，探讨32RMP基因对肝癌细胞的细胞周期的影响。Western印记法，以P标记的重组人RPB5探针从人肝［2-4］［5］癌细胞株的cDNA文库中筛查得到。Christine等1材料与方法在对线虫的研

4、究中发现RMP同源基因URI-1在线虫细1．1材料胞周期的有丝分裂和减数分裂、精子和卵子的生成、生SMMC-7721肝癌细胞由本实验室保存;E．coli殖细胞数量的调节、生育力以及种系生存力等多个环DH5α菌株、重组表达载体Nkcflag-RMP质粒为本科室节起作用。URI-1的缺失可能导致DNA复制中断，染保存;RPMI1640培养基、小牛血清购自Gibco公司;真色体缺陷以及DNA修复受损，三者共同导致内源性核表达质粒pGPU6-Neo-RMPi、pGPU6-Neo-SCRi的DNA损伤，从而引起细胞凋亡、细胞有丝分裂和减数分

5、［6］siRNA由上海吉玛公司设计并合成;BbsⅠ、HindⅢ和裂周期阻滞。这些研究结果表明RMP是一个重要BamHⅠ限制性内切酶、T4DNA连接酶购自MBI公司;的转录因子，在基因转录、细胞凋亡、基因组稳定性的TaqDNA聚合酶购自Fermenant公司;DL2000marker维持以及在肿瘤的发生发展中可能起到重要作用。购自TaKaRa公司;日常型小量质粒抽提试剂盒、PCR因为RMP首先是在肝癌细胞中筛查得到的，已有产物纯化试剂盒、DNA胶回收试剂盒购自杭州维特洁研究显示它可能与肝癌的发生发展有着一定的关［2-4］生化技术有限

6、公司;阳离子脂质体Lipofectamine2000、系。目前对于RMP的研究大多围绕在基因转录调Trizol购自Invitrogen公司;RT-PCR试剂盒、TaqDNA［2］节方面的作用，有关RMP基因在肝癌细胞的细胞周聚合酶购自Fermenant公司;酵母提取物、胰蛋白胨、琼期方面的研究尚未见文献报道。研究通过构建RMP脂粉等生化试剂购自上海生工生物技术有限公司;引收稿日期:2010-09-03修回日期:2010-10-18物由上海生工生物技术有限公司合成。*江苏省自然科学基金资助项目(BK2009121，BK2005028

7、)＊＊通讯作者，电子信箱:wenxiangw@suda．edu．cn2011，31(5)郭云兰等:RMP基因干扰对肝癌细胞周期的影响91．2方法250μl，混匀，室温孵育5分钟。轻轻混合A、B两液，室1．2．1载体构建根据美国国立生物技术信息中心温放置30分钟后补加500μl无血清RPMI1640培养基(NationalCenterforBiotechnologyInformation，NCBI)数稀释。转染:用无血清RPMI1640漂洗六孔板中的细胞据库中RMP基因(GenBank编号:NM134447)的cDNA2次。把转染液

8、缓缓均匀的滴加入六孔板中，两孔为碱基序列，设计针对RMP基因的最佳干扰序列si-RNAi实验组，两孔为阴性对照空质粒组，两孔为细胞RNA，为5'-GGAUUUGCUAGCUGAUAAATT-3'，经对照组。37℃，5%CO2条件下培养6h后每孔补加