益气活血中药对血管生成pi3k和mapk信号途径的影响

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1、中曲医结合心脑血管j丙杂志2Ol0年9月第8卷第9期·1083·益气活血中药对血管生成PI3K和MAPK信号途径的影响王培利。雷燕，王承龙摘要：目的探讨益气活血代表方当归补血汤对缺血心肌血管新生信号转导途径的影响。方法运用免疫组织化学方法检测血管内皮生长因子(VEGF)在缺血心肌中的表达，同时运用Western—blotting蛋白检测方法，对缺血·,12肌的p38促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)以及蛋白激酶B(Akt)蛋白进行分析。结果益气活血方当归补血汤可以促进缺血

2、心肌VEGF的表达，同时具有不同程度地促进PI3K以及Akt蛋白表达的作用，以中剂量组效果最为明显。结论益气活血代表方当归补血汤可能通过激活PI3K，从而引起下游蛋白Akt的进一步表达。将信号传至核内，引起VEGFmRNA的表达，产生促血管生成效应。关键词：益气活血方：当归补血汤；血管新生；促分裂原活化原白激酶；磷脂酰肌醇3激酶中图分类号：R543R285．5文献标识码：A文章编号：1672—1349(2O10)O9—1083—03近来研究发现磷脂酰肌醇3激酶(ph()sphatidyJinosit

3、o{3l_3．2实验药物当归补血汤中黄芪Astragalusmembrana—kinase，PI3K)与血管平滑肌细胞的增殖密切卡¨关，许且ceus(Fisch)Bunge、当归Angelicasinensis(Oliv)Diels，均系干PI3K信号途径在介导人肺血管平滑肌细胞的增殖和迁移巾起品，南中国中医研究院中药所鉴定为正品。黄芪、当归按5：1重要作用]。低氧可以激活肿瘤细胞中的PI3K途径而调细比例合煎，并浓缩至含生药1g／mI，4℃保存备用，大、中、小剂胞的增殖与凋亡l4]。但在缺血心肌中

4、PI3K表达如何还未见报量分另Ⅱ为1．2#1oo(g·d)、0．6g／100(g·d)、0．3g／100(g·d)。道。Akt又称蛋白激酶B(proteinkinaseB，PKB)，是一种丝氨倍他乐克：阿斯利康制药有限公司，批准文号：国药准字酸／苏氨酸蛋白激酶。Akt是细胞生存的关键因子。多种生长H32025390，批号200311002，每只大鼠给药2．5mg／100因子主要通过PI3K／Akt信号转导通路而发挥作用。激活后的(g·d)。Akt主要通过对含有丝氩酸／苏氨酸残基的底物磷酸化而发挥l_

5、3．3心肌梗死大鼠的制备采用冠脉结扎法，术后腹腔内注广泛的生物学效应，包括抗凋亡、促细胞牛存和增殖功能。同射青霉素钠8×1OU／d，连续3d抗感染。造模成功大鼠随机时，PI3K活化后可以直接调节促分裂原活化蛋白激酶(mitogen—分成正常组、模型组、倍他乐克组、当归补血汤大剂量组、当归补activatedproteinkinase．MAPK)途径，其中包括ERK途径和血汤中剂量组、当归补血汤小剂量组。用药组灌服当归补血汤JNK途径。当归补血汤具有促进缺血心肌大鼠血管生成作煎剂和倍它乐克水溶液，其他

6、组灌服生理盐水，均为2周。用’J。本实验探讨了当归补血汤对心肌缺血后PI3K、1．3．4免疫组化技术测定左室梗死边缘区VEGF表达量心Akt／PKB、MAPK信号转导途径的影响，以期明确当归补血汤肌组织切片经脱蜡至水，3HO灭活内源性过氧化酶，枸橼促进血管新生的信号转导机制。酸缓冲液热修复．0．01MPBS缓冲液洗涤，山羊血清封闭液封1材料与方法闭，一抗孵育4℃过夜，0．01MPBS缓冲液洗涤，二抗孵育，l_1主要试剂Folin酚(北京鼎国生物技术公司产品)，丙烯0．01MPBS缓冲液洗涤，SABC

7、试剂孵育，光学显微镜下观察心酰胺、甘氨酸(Promega)，硝酸四氮唑蓝(NBT)、5一溴一4一氯一3肌微血管特异性显色。采用ImageProPlus4．0图像分析软件一吲哚磷酸(BCIP)，硝酸纤维素膜(Gelman公司)。蛋白质电泳采集数据，计算阳性区域所占总面积。用第二抗体：碱性磷酸酶标记的羊抗兔抗体(北京中杉金桥公1．3．5蛋白定量两周后麻醉取材。切下梗死边缘区；将其置司)。Trisbase、十二烷基硫酸钠，过硫酸铵，溴酚蓝，胰蛋白酶，于eppendorf管中加入预冷的0．01MPBS液洗涤

8、2次；按照1：乙二胺四乙酸，1mM苯甲基磺酰氟，0．1抑蛋白酶肽(Sig—5加入预冷组织裂解液，Folin酚法定量蛋白；分装上清，ma)。PI3K及Akt单克隆抗体试剂盒购自北京宣武医院多肽于一7O℃保存。实验室。p38丝裂素活化蛋白激酶活性测定试剂盒(CellSigna1．3．6Western免疫印迹方法应用微量加样器加人25Lling)。血管内皮生长因子(VEGF)，购自武汉博士德生物工程样品，第一抗，置于摇床上摇动，室温下2h。倾去一抗，PBS洗有限公司；膜3次