CTAB法枯草芽孢杆菌(Bacillus-subtilis)基因组DNA的提取.doc

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1、CTAB法枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）基因组DNA的提取内容提要以枯草芽孢杆菌为材料，采用CTAB法（十六烷基三甲基溴化铵）提取枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）的基因组DNA作为基因扩增的模板，并测定其含量和纯度。本实验要求：提取高质量的基因组DNA为下一步的基因操作准备。原理高纯度、高分子量的基因组DNA是构建基因组文库、Southern杂交(包括RFLP)及PCR等后续的分子生物学操作的基础。利用基因组DNA较长的特性，可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中，可用玻棒

2、将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部，从而达到提取的目的。在提取过程中，染色体会发生机械断裂，产生大小不同的片段，因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作，如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓，以保证得到较长的DNA。一般来说，构建基因组文库，初始DNA长度必须在100kb以上，否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析,DNA长度可短至50kb，在该长度以上，可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下)，并可保证包含PCR所扩增的片段(一般2kb以下)。不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同；不同种类或同

3、一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法,以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用，因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时,应考虑除去多糖和酚类物质。DNA的含量与纯度在研究工作中十分重要，常常需要测定。目前使用较多和较简便的是紫外吸收法。核酸在260nm波长有一特征吸收峰，根据其光密度（OD）值可计算DNA浓度。蛋白质在260nm波长处有一特征吸收峰，在260nm处的吸收值仅为核酸的十分之一或更低，因此当核酸样品中蛋白质含量较低时，对核

4、酸的紫外测定影响不大。DNA的260nm与280nm吸收比值在1.8左右，当制品中蛋白质含量较高时此比值下降，比值大于2时表明RNA及核酸碎片多，比值在1.8-1.99表明纯度较好。一、主要仪器、材料、和试剂1.仪器移液器，高速冷冻离心机，台式离心机，水浴锅，紫外可见分光光度计。2.实验材料枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）3.试剂⑴.CTAB/NaCl溶液：4.1gNaCl溶解于80mlH2O，缓慢加入10gCTAB，加水至100ml。⑵.氯仿：异戊醇(24:1)，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，异丙醇，70%乙醇，TE（10mMTris-HCl，1mMEDTA,

5、pH8.0），10%SDS，蛋白酶K(20mg/ml或粉剂)，5mol/LNaCl。二、操作步骤1.取100ml过夜培养的菌液，5000rpm离心10分钟，弃上清液。2.菌体沉淀用10mlTE悬浮，并加0.5ml10%SDS，50μl蛋白酶K，混匀，37℃保温1小时。3.加1.5ml5mol/LNaCl，混匀。再加1.5mlCTAB/NaCl溶液，混匀，65℃保温20分钟。4.用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提，5000rpm离心10分钟，移取上清液至干净离心管。5.用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提，取上清液移至干净管中。6.加1倍体积异丙醇，颠倒混合，室温下静止10

6、分钟，10000rpm离心15分钟得到DNA沉淀。7.加入700μl70%乙醇，70μl3MNaAc漂洗DNA沉淀，溶解于1mlTE，-20℃保存。8.去除RNA：加5μlRNase加1/10体积3MNaAc加2倍体积无水乙醇10分钟后，将DNA沉淀溶于1mlTE，-20℃保存。9.用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性。10．用分光计测定浓度及纯度：产品DNA溶液用TE缓冲液适当稀释后以TE调零，在260nm和280nm处分别测光密度OD值，计算DNA浓度（经验公式ug/ml=OD260×50×稀释倍数）以及含量、产率计算OD260/OD280比值，评价其纯度。