基因组简化枯草芽孢杆菌的构建及应用

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1、ＴＩＡＮＪＩＮＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ帽第－臟代大学ＦＯＵＮＤＥＤＩＮ１８９５士位论ｇ＾ｇ一级学科化学工程与技术：学科专业：生物分子工程作者姓名：李杨指导教师：赵学明教授天津大学研究生院２０１７年５月基因组简化枯草芽孢杆菌的构建及应用ConstructionofgenomereducedBacillussubtilisandtheirapplicationinproductionofbio-basedchemicals（国家自然科学基金项目NSFC-21176182

2、资助）一级学科:化学工程与技术学科专业：生物分子工程研究生：李杨指导教师：赵学明教授天津大学化工学院2017年5月摘要本文以模式菌株Bacillussubtilis168为研究对象，通过基因组连续删减操作，构建了一系列不同简化程度的基因组简化枯草芽孢杆菌菌株。研究了基因组简化操作对菌株形态、生理、遗传稳定性等方面的影响。在此基础上，以代表性基因组简化菌株作为底盘细胞，分别引入特定目标产物相关途径修饰，以此探究了基因组简化菌作为细胞工厂底盘细胞的特点和优势潜力。主要结果如下：利用无痕删除技术逐步删减去除了基因组上噬

3、菌体区（pro1～6，spβ,skin，PBSX）,抗生素操纵子区(pps，pks)以及部分非必需基因区(ycxB-sipU，yisB-yitD，pdp-rocR，yrkS-yraK，yybP-yyaJ,ydeK-ydjC，lytH–yurT，sboA-ywhH)，获得一系列精简程度不同的基因组简化菌株，最多删减了845.6Kb（精简20.1%）。基因组简化枯草芽孢杆菌菌株的生理特征发生了变化，在基本盐培养基培养条件下，基因组简化菌株生长速率下降，细胞得率提高，细胞自溶性下降，转化率、产孢率以及维持能系数都下降趋

4、势。基因组简化菌株在微氧发酵培养条件下生长比对照出发菌株快，乙偶姻得率与对照菌株差别不大。通过引入acoA、bdhA缺失突变，与同等修饰的对照菌株相比，基因组简化菌株产乙偶姻的产量、得率有所提高。在基因组简化菌株BSK756、BSK814和出发菌株BSF1中，分别敲除了purA，过表达prs、purF和guaB，菌株BSK756、BSK814鸟苷产量分别是104.2mg/L和115.2mg/L，分别是对照菌株的4.1倍和4.4倍。以BSK756为对象，引入胸苷合成相关基因修饰（敲除tdk，过表达prs，并过表达E

5、.coli来源的prs、ushA、thyA、dut和ndk），得到菌株BSK756T3，该菌株产胸苷151.2mg/l，相比于野生型菌株增长5.2倍，得率也有所提高。以菌株BSR0（Bacillussubtilis168Δupp::spc,ribC*）为出发菌株进行基因组删减，与出发菌株相比，基因组简化菌株的核黄素略有增加。分别在基因组简化菌株BSR563和出发菌株BSR0引入过表达purF、purF置换以及强化表达核黄素操纵子等一系列遗传修饰，实验表明，与对照菌株BSR0R5相比，BSR563R5核黄素产量增长

6、了77%，显示了基因组简化菌在代谢改造生产核黄素的优势。关键词：枯草芽孢杆菌；基因组简化；底盘ABSTRACTInpresentstudy,Bacillussubtilis168wasselectedtoreducegenomevialargescaledeletionandaseriesofgenome-reducedstrainofBacillussubtiliswereconstructed.Weinvestigatedchangesinphysiologicalphenotypeofgenome-redu

7、cedmutants.Somegenome-reducedstrainswereengineeredtoproduceguanosine,thymidine,acetoin,riboflavinbyintroducingsomespecificgeneticmodifications.Protentialofgenome-reducedstrainaschassiscellwereevaluated.Themainresultsareasfollows:Wesequentiallydeletedallpropha

8、ge,largeoperonsforsecondarymetabolitebiosynthesisandsomenonessentialregionsviaascarlessgenedeletionmethod.Thesizesofdeletedregionsfinallyaddedupto845.6kb.Thesegenomereducedstrainsshowedde