不同浓度益气活血方含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞体外增殖及VEGF表达的影响.pdf

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1、中医杂志2014年7月第55卷第13期JournalofTraditionalChineseMedicine，2014，Vo1．55，No．13实验研究不同浓度益气活血方含药血清对大鼠骨髓问充质干细胞体外增殖及VEGF表达的影响黄凤一，段行武，匿，李健。，赵明镜，荣培晶，徐旭英，I=(1．北京中医药大学东直门医院，北京东城区海运仓胡同5号东直门医院，100029；2．首都医科大学附属北京中医医院；3．北京中医药大学基础医学院；4．中国中医科学院针灸研究所)基金项目：北京市自然科学基金项目(7122084)；北京市卫生系统高层次卫生技术人才培养计划(20

2、13—3—080)；北京市科委首都临床特色应用研究(Z131107002213117)；北京市中医药科技年度规划项目(WZF2012—02)[摘要]目的探讨不同浓度益气活血方含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖活力及血管内皮生长因子(VEGF)的影响。方法将8只SD大鼠随机分为空白对照组4只、益气活血方组4只，纯化培养BMSCs，采集空白对照组(灌胃蒸馏水)、益气活血方组(灌胃益气活血方)大鼠血清；将BMSCs分为空白血清对照组、5％、10％、20％益气活血方血清组，分别以含1O％空白血清及含5％、10％、20％益气活血方血清培养液干预培养

3、BMSCs。M1Yr法检测BMSCs增殖活力，ELISA法检测培养BMSCs上清液VEGF水平。结果第2天、第4天、第6天，10％益气活血方血清组BMSCs去基线增殖率较5％益气活血方血清组与20％益气活血方血清组明显增加(P<0．05或P<0．01)；第2天、第4天组间BMSCs上清VEGF水平比较，10％益气活血方血清组明显高于空白血清对照组、5％益气活血方血清组、20％益气活血方血清组(P<0．01)。结论l0％益气活血方含药血清可明显提高BMSCs增殖能力，促进VEGF表达。[关键词]骨髓间充质干细胞；细胞增殖；益气活血方；血管内皮生长因子骨髓

4、间充质干细胞(bonemarrowmesenchymal华实验动物技术有限公司，实验动物许可证号：stemcells，BMSCs)是一种来源于骨髓，具有多向SCXK(京)2012—0001。分化潜能与分裂增殖能力的细胞，在特定条件下可1．2主要试剂和仪器诱导分化为内皮细胞¨J、软骨细胞J、骨细胞j、低糖DMEM培养基(L—DMEM，美国Gibico脂肪细胞、心肌细胞、神经细胞等，是干公司，批号：20130624)，噻唑兰(M1丫r，美国细胞疗法常用细胞之一。但骨髓中的BMSCs数量Amresco公司，批号：705B0510)，大鼠VEGF很少，必须经过

5、体外的扩增传代、纯化才能符合基ELISA试剂盒(上海联硕生物科技有限公司，批础与临床应用要求j。本研究探讨不同浓度益气号：AE98006Ra)。活血方含药血清对BMSCs增殖活力及血管内皮生CKX41倒置相差显微镜(13本Olympus公长因子(VEGF)表达的影响，为益气活血法联合司)，TDZ4一WS低速离心机(湖南赛特湘仪公司)，干细胞疗法治疗缺血性疾病提供依据。MCO．20AJC二氧化碳培养箱(日本三洋公司)，1材料MK3酶标仪(芬兰雷勃公司)，流式细胞仪(美国1．1实验动物BD公司)。清洁级雄性sD大鼠4只，体重100—120g，1．3药物提取

6、BMSCs；清洁级雄性SD大鼠8只，体重益气活血方由黄芪120g、党参120g、炙甘草280～300g，制备含药血清。动物均由北京维通利48g、当归120g、鸡血藤120g、川牛膝48g组成。由北京中医医院中药房加工浓缩至含生药1．5g／ml通讯作者：xxying7341@126．tom，(010)52176642(相当于成人临床用药量的18倍)药液。中医杂志2014年7月第55卷第13期JournalofTraditionalChineseMedicine，2014，Vo1．55，No．132方法组别加入不同浓度血清培养1天后，行MTT法检测细胞活力

7、，连续检测7天。去基线增殖率=2．1含药血清制备(实验组OD值一空白血清对照组OD值)／空白血将8只雄性SD大鼠采用随机数字表法分为空清对照组OD值×100％。白对照组与益气活血方组，每组4只。益气活血方2．5ELISA法检测VEGF水平组灌胃益气活血方10ml／(kg·d)，空白对照组灌收集第2天和第4天培养BMSCs的上清液采胃等量蒸馏水，连续7天，末次灌胃2h后，腹主用ELISA法检测VEGF表达水平，按照试剂盒说明动脉取血，静置30min，分离血清，56cIC灭活书操作，样品设3个复孔。30min，无菌分装，一2O℃备用。2．6统计学方法2．2

8、BMSCs培养及鉴定采用SPSS19．0统计软件进行数据分析，计量将大鼠麻醉，无菌条件下取出后