DB37T 3319-2018 水貂、狐和貉犬瘟热病毒等10种病毒性病原实时荧光PCR检测方法.doc

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1、ICS 65.020.30B41     DB37山东省地方标准DB37/T3319—2018     水貂、狐和貉犬瘟热病毒等10种病毒性病原实时荧光PCR检测方法Real-timefluorescentPCRfordetectingofdistempervirusandother10viralpathogensofmink,foxandraccoondog2018-06-12发布2018-07-12实施山东省质量技术监督局   发布DB37/T3319—2018前  言本标准按照GB/T1.1—

2、2009给出的规则起草。本标准的附录为资料性附录。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：山东省动物疫病预防与控制中心、山东大学生命科学学院、威海市动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：王贵升、王金宝、田夫林、张鹤晓、崔凯、张月、张华杰。6DB37/T3319—2018水貂、狐和貉犬瘟热病毒等10种病毒性病原实时荧光PCR检测方法1　范围本标准规定了水貂、狐和貉犬瘟热病毒等10种病毒性病原实时荧光PCR检测方法。本标准所规定的实验室检测方法适用于

3、水貂、狐和貉的犬瘟热病毒、细小病毒、冠状病毒、轮状病毒、星状病毒、阿留申病毒、杯状病毒、博卡病毒、圆环病毒、伪狂犬病毒等10种病毒的荧光PCR检测方法，其他动物参考。2　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法3　缩略语荧光PCR实时荧光聚合酶链式

4、反应Ct值每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环圈数DNA脱氧核糖核酸RNA核糖核酸Taq酶TaqDNA聚合酶PBS磷酸盐缓冲生理盐水4　试剂和材料4.1　荧光定量PCR检测仪及配套反应管（板）。4.2　高速台式冷冻离心机（离心速度12000r/min以上）。4.3　混匀器。4.4　恒温水浴锅。4.5　冰箱（2℃～8℃和-20℃两种）。4.6　微量移液器（0.5L～10L，5L～20L，20L～200L，200L～1000L）及配套吸头。4.7　1.5mL离心管（无核酸酶）。4.8　D

5、NARNA核酸提取试剂等。5　样品的采集与前处理6DB37/T3319—2018采样过程中样本不得交叉污染，采样及样品前处理过程中须戴一次性手套。1.1　取样工具1.1.1　棉拭子、剪刀、镊子、研钵、Eppendorf管。1.1.2　所有上述取样工具必须经（121±2）℃，15min高压灭菌并烘干或经160℃干烤2h。1.2　采样方法1.2.1　拭子样品a)咽喉拭子采样，采样时要将拭子深入喉头及上腭来回刮3次～5次，取咽喉分泌液。然后将拭子插入到装有1.0mLPBS无菌Eppendorf管中，编号

6、备用。b)肛拭子采样，采样时要将拭子深入肛门回刮3次～5次，取排泄物。然后将拭子插入到装有1.0mLPBS无菌Eppendorf管中，编号备用。1.2.2　内脏或肌肉样品用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品1.0g于研钵中充分研磨，再加5.0mLPBS混匀，然后将组织悬液转入无菌Eppendorf管中，编号备用。1.2.3　血清或血浆用无菌注射器直接吸取至无菌Eppendorf管中，编号备用。1.3　存放与运送采集或处理的样本在2℃～8℃条件下保存应不超过24h；若需长期保存，须放置-70℃以下冰箱，但应

7、避免反复冻融（最多冻融3次）。采集的样品密封后，采用保温设施加冰密封，尽快运送到实验室。2　引物及探针引物及探针见表1“荧光PCR方法的引物及探针”。表1　荧光PCR方法的引物及探针RNA病毒犬瘟热病毒FGCAAGCGAGGATTGAGGGTATRGGCCTATGGGACACACTCAAAProbeFAM-CACCGACCATCCAGACGTTGCTCCT-BHQ星状病毒FTCCAGGCATTTGAGTATGCCRCCACATAATCCTGGGGGAProbeFAM-CGGGAGTCGTGGGAC-

8、BHQ冠状病毒FTGGGAC(T)TATCCT(A)AAG(A)TGTGARTAA(G)CACACAACNCCATCATCProbeFAM-CGGGAGTCGTGGGAC-BHQ杯状病毒FCTGACTTCAAATTTCATCTCRTGGGAATTAAGTCAGAGGProbeFAM-ATCTATGCTCACTCATGGATCTGTC-BHQ轮状病毒FTTTATAGATAATGTATGTATGGATGRCCAATTCTCAATGTAATCAGProbeFAM-AATAG