神经肽在神经化组织工程骨中表达的早期实验研究

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1、堑l江型!至箜鲞笙4期ZHJJTraumatic，August2010，vo1．15，No．4·439··基础研究·神经肽在神经化组织工程骨中表达的早期实验研究姚旺祥马安裴国献随着骨组织工程研究深入以及向临床过渡的逐其固定在侧槽内，为感觉神经植入组。切开股内侧渐展开，一个主要的问题就是如何构建大块组织工肌，可见由股神经发出的支配股内侧肌的肌支，游离程骨在体内存活并发挥功能作用。而神经系统在骨一段长度后切断，通过内侧肌间隙将此神经束植入中的分布与功能的研究深入，为神经因素融人到组组织工程骨的侧槽内，为运动神经植入组：将两者联织工程骨的构建中来提供了理论依据和经验。临床合植人为感觉、运动神经束联

2、合植入组。仅仅分离出常用神经植入方法来重建受区的神经支配，笔者利感觉、运动神经束而不切断者为对照组。生理盐水冲用显微外科技术，将感觉神经、运动神经及两者联合洗伤口后逐层缝合，包扎切口。术后每天肌注青霉素植入大段组织工程骨中，从组织学上分析植入神经40万U。连续3天对组织工程骨早期成骨的影响，并利用降钙素基因1．3观察指标相关肽(Caleitoningenerelatedpeptide．CGRP)的免疫1．3．1大体标本观察：各组分别于术后第4周、8周、组化染色来初步观察其促进成骨的机制12周各处死4只动物。完整截取骨缺损侧股骨，观察骨缺损区新骨形成情况、与宿主骨界面结合情况及1材料与方法周围

3、软组织反应。1．1动物模型与实验分组：新西兰大白兔48只(购1-3．2组织学切片观察：对骨缺损区组织以4Og／L的自南方医院实验动物中心)，体质量2．0～2．5kg，6个多聚甲醛固定，150g／L的乙二胺四乙酸脱钙后石蜡月龄，雌雄不限。抽取自体骨髓，体外扩增骨髓基质包埋，连续横行及纵行切片，厚度5m，行HE及干细胞。取第4代骨髓基质干细胞按6~106-8x10个／MASSON染色。每只动物取3张横行间断切片在100ml的密度接种到直径8ram、带侧槽的、多孔B一磷酸倍光镜下观察新骨形成情况。每张切片随机取5个三钙(购自武汉华威公司)支架上构建组织丁程骨，视野，分析新生骨小梁面积象素值，并计算

4、其占视野体外培养7d后备用。实验动物随机分为4组：A组，总面积象素值的百分数。单纯组织工程骨组；B组，组织工程骨+运动神经束植1．3．3免疫组织化学染色：多克隆羊抗兔降钙素基入组；C组，组织工程骨+感觉神经束植入组；D组，组因相关肽(Caleitoningenerelatedpeptide，CGRP)抗体织工程骨+感觉、运动神经束联合植入组。及过氧化物酶标记的兔抗羊IgG(Chemican公司)。采1．2神经植入组织工程骨动物模型的制备：参照本用SABC法．用已知CGRP阳性表达的切片做阳性对课题组的做法lJ1．所有动物均于右侧后肢股骨前外侧照，PBS液分别代替一抗、二抗及SABC液作阴性对

5、做一纵形切口，长约7cm，切开深筋脉，从肌间隙内分照。图像分析测定染色的灰度值，再计算出每张切片离显露股骨。于股骨前侧放置已塑形好的4孔普通的平均灰度值(平均灰度值与免疫表达强度呈反比)。钢板，于钢板第2、3孔之间以手外科钢锯截取1．5cm1．4数据处理：所有参数采用SPSS10．0统计软件检长股骨与骨膜缺损．于缺损处嵌入组织工程骨后穿验均呈正态分布，同一时间不同组标本的新生骨组两条一号线备用，再依次缝合伤口。再在股骨内侧正织在骨缺损区域所占面积、免疫组化各组平均灰度中做一长约5cm的纵切口，逐层切开，暴露深筋膜，值检测数据的比较均采用单因素方差分析，以P≤即在股三角内可见大隐神经f兔大隐神

6、经为股神经的O．05为有统计学意义，若差异有统计学意义再用延续，与股血管伴行1，游离适当长度后将大隐神经锐SNK法行多重比较。性切断，将近端神经作束间适当分离，通过内侧肌间隙成爪状尽量多的植入组织工程骨内．两股丝线将2结果所有动物术后饮食正常，有2只动物f一只为A作者单位：310006杭州，浙江省杭州市第一人民医院·440·浙江创伤外科2010年8月第15卷第4期ZHJJTraumatic，August2010，Vo1．15，No．4组．一只为C组)于手术后1周内死于腹泻，再次手术状骨髓周围，但不局限于其周围，且此时可见新生骨补齐实验所需．其余动物手术切口无红肿及渗液，I边缘及骨膜处分布最多

7、；3月时的观察与2月时所见期愈合。无明显区别。A组与B组：前2月均未见CGRP的表2．1大体标本观察：术后4周时A组与B组标本在达，仅在3月时见CGRP弱表达于新生骨的边缘处。两接触面及材料表面均被结缔组织包裹，材料与骨对植人物区新生骨组织内CGRP染色灰度值(表1～接触面能折动．而C组与D组标本材料表面为薄层2)的统计学分析显示随着时间的延长，各组新生骨软骨样与纤维样骨痂包裹，两断端问能轻微折动。术组织内C