细菌mrna的提取方法

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1、万方数据万方数据2003年第1期庞听等：细菌mRNA的提取方法31是mRNA降解的标志Ⅲ^⋯。正是由于细菌n汛NA具有以上特点，使得n汛一NA在众多tRNA和rRNA存在的情况下难以分离和选择性标记mRNA。这给mRNA纯化及单链cDN恕分子的合成带来极大困难。2原核微生物mRNA纯化及标记一般的方法是先提取细菌的总RNA或获得含总RNA的粗提物，再从中纯化血州A，然后合成被标记的c七INA分子。2．1总RNA的提取分离纯净、完整的RNA是分子克隆和基因表达分析的基础，而实验成功与否的关键是有无RNA酶的污染。RNA酶几乎无处不在，而且特别稳定。故在提取RNA时，最关键

2、因素是最大程度地避免外源RNA酶的污染和抑制内源RNA酶的活力，必要时使用特异的RNA酶抑制剂。2．1．1总RNA提取的传统方法其基本流程是根据实验需要将细菌培养至一定时期，破碎细胞，抽提蛋白，提取核酸，然后去除污染的DNA、蛋白、盐等杂质。几乎所有分离提取RNA方案的第一步操作都是在能导致RNA酶变性的化学环境中(如硫氰酸胍、异硫氰酸胍、盐酸胍、饱和酚等)裂解细胞，然后才将RNA从各种大分子中分离出来。因为细胞裂解的同时，RNA酶被释放出来，这种内源性的RNA酶是降解RNA的主要危险之一。所以原则上要尽可能地尽早去除细胞内蛋白，加入RNA酶的抑制剂，力争在提取的起始阶

3、段对RNA酶活力进行有效的抑制。目前，最常用的提取方法当推1987年chom．唧，nski等lllJ提出的“硫氰酸胍．酚．氯仿抽提法”(简称“一步法”或AGPC法)，其优点是收获非降解RNA产量大、纯度高，不需要超速离心或多步酚一氯仿抽提。GIB㈣L公司【12J在此基础上研制了TRIZOL试剂，已被广泛应用。吴丽娟等L”J建立了改进的SD＆Ph。ol法快速提取细胞总RNA，也可用来提取大量细菌的RNA样品。该方法比AGPC法更为优越，其产量高，RNA完整性好，纯度略高于AGPC，且该法操作简单，全程只需2h，无需超速离心和多次酚．氯仿抽提，是～种快速高效的总础qA提取方

4、法。deSa谶eu等【21和Sdinger等[14]用热的水饱和酚法提取RNA，因为60℃～65℃能确保细胞快速溶解，并且RNA酶没被激活。deSaizieu等将细菌培养至对数生长期，离心收集细胞后液氮中冷冻保存，使用时将细胞重悬在60℃预热的水饱和酚(pH<7．0)中。然后用酚、氯仿抽提，获得总RNA。Selinger等_14J的方法则是直接将细菌注射人热水饱和酚、氯仿(5：1)溶液中。D承isi实验室【15o提取I州A的方法更为先进。他们用预冷的水饱和酚／乙醇阻断液使RNA稳定，然后用溶菌酶、Sc)S破壁，再用热的水饱和酚、氯仿抽提。最近，用RNALater溶液(A

5、mbinandQiagen)和RNAprotectBacte血Reagent(Qiagen)稳定总RNA使用较多，该溶液的优点在于可以快速稳定“州A群体，允许样品在提取RNA之前在适宜条件下保存较长时间，尤其适用于多次收集样品后才可开始RNA的纯化。RNA提取过程中，除去污染的DNA很重要，特别是对下一步的RT_PcR和生物芯片技术来说。因为在cDNA合成／标记反应中，污染的DNA也因被标记而形成芯片上的高背景。所以，提取过程中，有必要使用DNA酶或Ambion的DN俳fra汀M试剂盒以除去DNA。selinger等1141还发现：RNA样品中污染了培养基中的盐和糖分会

6、抑制逆转录合成cDNA的反应。在第一次沉淀核酸后，经过柱纯化后cDNA的产量会大幅度提高。2．1．2试剂与试剂盒许多公司㈦16～20]根据科研需要，研制出一些提取RNA用的试剂或试剂盒，表1列举了这些方法的比较。ABI公司L211开发研制了ABIPRIs叫刑6100核酸提取仪。这是一个小型、多用途、快速而又经济的核酸纯化平台，半个小时即可完成96个样品的纯化工作，并且可纯化来自多种生物样本的总RNA和基因组研慵。2．1．3RNA纯度及完整性的检测最常用的方法是用紫外分光光度计测OD260mn和OD280m值，以计算其含量和纯度。其次是在变性胶上进行凝胶电泳，EB染色，紫

7、外灯下肉眼判断其纯度和完整性。此法简单，但灵敏度低，至少需要200“g的鼢峨。如果用s'r王泯oGold和SⅥ猥国GreenII染色，则能分别检测到1pg和2耀的RNA，极大的提高灵敏n瓣銎瓤：。咎灞嘲藓辫溅器淄瓤自瓿万方数据32生物技术通报埘。咖hnD^曜y舶m砌2003年第1期度。安捷伦公司的～igent2100生化分析仪与RNAJ，abchi严联用，灵敏度高，样品量少，每次分析仅需5馏的样品就能检测其浓度、完整性和纯度，且能及时发现RNA的降解，但普通的实验室很难有此条件。2．2细菌mRNA的纯化拳1不同公司研懈的提取褂IA试剂盍比