细胞mRNA的提取

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1、技术方法名称细胞mRNA的提取基本原理一个典型的哺乳动物细胞含有约10-5ug总RNA，其中80～85%是核糖体RNA（主要有28S，18S，5.8S和5S四种）。剩余的15～20%中大部分由不同的低相对分子量的RNA组成（如转运RNA和小核RNA）。这些高丰度的RNA的大小和序列确定，可通过凝胶电泳、密度梯度离心、阴离子交换层析和高压液相层析（HPLC）分离。相反，占RNA总量1～5%的信使RNA即mRNA无论大小还是序列都是相异，其长度从几百碱基到几千碱基不等，其实际含量也随着细胞类型的不同而不同，随细胞生理状态的

2、变化而变化。在单个哺乳动物细胞中，大约有360,000个mRNA分子，12,000种不同的mRNA分子。有些mRNA在mRNA群体中的比例约为3%，而其它一些mRNA所占的比例则不超过0.01%。这些稀有或低丰度mRNA的拷贝数大约是每个细胞5～15个。然而，这些低丰度mRNA有11,000种，占mRNA群体的45%。在真核生物中，大部分mRNA（组蛋白除外）都是聚腺苷酸化的，其约200个腺苷酸残基构成的3’尾部为分离真核mRNA提供了有效的方法。寡聚（dT）可以与poly（A）尾相结合，被用于回收mRNA。传统方法是

3、将提取的总RNA（用酚-氯仿抽提细胞裂解液）通过寡聚（dT）纤维素柱来制备。但为了能将核酸酶造成的损伤降至最低，现在常采用一种更迅速的方法即直接将结合着寡聚（dT）的磁珠加入到细胞裂解液中，再用强磁铁将磁珠吸出再洗出mRNA。某些情况下，裂解细胞后用蔗糖梯度来制备mRNA-核糖体复合物可以作为mRNA提取的替换途径。因为核糖残基在2’和3’位带有羟基，所以RNA比DNA的化学性质更活跃，易于被污染的RNA酶—具有水解核糖残基和磷酸间二酯键能力的酶切割。由于RNA酶从裂解的细胞中释放且存在于皮肤上，故要小心防止玻璃器皿、

4、操作平台以及浮尘中RNA酶的污染。目前尚无使RNA酶失活的简易办法。链内二硫键的存在使许多RNA酶可抵抗长时间煮沸和温和变性剂，变性的RNA酶可迅速重新折叠。和大多数DNA酶不同，RNA酶不需要二价阳离子激活，因此难以被缓冲液中加入的EDTI或其他金属离子螯合剂失活。防止RNA酶最好的方法就是避免污染。提取细胞mRNA后，可通过mRNA翻译、凝胶电泳或NorthernBlot分析来检测mRNA的完整性，通过紫外分光光度计来检测mRNA的纯度。用途及受限因素■酶学研究■cDNA文库构建■RT-PCR■S1核酶分析■引物扩

5、增■核糖核酸酶保护■分子杂交■体外转录■差异显示■基因表达分析mRNA在细胞总RNA中的比例很低，需要大量的样本用于mRNA的提取，这就大大限制了稀有样本的检测。细胞mRNA的提取—以Promega公司的PolyATtractSystem1000为例基本原理任何一种RNA提取方法都包括以下四个步骤：1）高效裂解细胞或组织；2）变性核蛋白复合物；3）灭活内源性的RNase活性；4）纯化RNA。所有这些步骤中最重要的是，立即灭活细胞裂解后从膜包围的细胞器中释放出的内源性RNase。用强烈变性如盐酸胍或硫氰酸胍溶液能迅速溶解

6、蛋白质，导致细胞结构破碎。PolyATtract®System1000利用硫氰酸胍（GTC）和β-巯基乙醇来灭活细胞抽提液中的核酸酶，利用GTC和SDS来变性核蛋白复合物。核蛋白由于其二级结构的破坏而从核酸上解离下来，使得RNA从溶液中释放出来，并与蛋白质分离。最终GTC的浓度允许mRNA的poly(A)与合成的生物素化的Oligo(dT)探针退火，但仍能完全抑制细胞内的RNases。短暂的离心完成杂交，并去除细胞碎片和沉淀的蛋白质。离心后，用StreptavidinMagneSphere®ParamagneticPa

7、rticles(SA-PMPs)来捕获生物素化的Oligo(dT):mRNA杂交分子。先用高严谨性的条件洗涤磁珠，然后用Nuclease-FreeWater洗脱，便可获得纯化的mRNA。实验材料实验耗材细胞刮子、微量移液器、量筒、烧杯、盐水瓶、止血钳、锡箔纸、药勺；进口Tip、Tube试剂NaAc、NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4、无水乙醇、异丙醇等，均为分析纯，且最好是新的未开封的；DEPC，焦碳酸二乙酯，购自Invitrogen公司；PolyATtractSystem1000，Cat#Z5400购自P

8、romega公司。实验前的准备（包括溶液的配制及无RNAase和DNAase环境的建立）1.无RNAase和DNAase环境的建立²玻璃制品、铁制品、塑料制品和电泳槽无菌的一次性使用的塑料制品（进口）基本上无RNA酶，可以不经预处理直接用于制备和贮存RNA。但为了保险起见，将它们装入无RNase和DNase的铁饭盒（干烤：300℃