fasl mrna在椎间盘细胞中表达的分布

《fasl mrna在椎间盘细胞中表达的分布》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、FasLmRNA在椎间盘细胞中表达的分布：司春祥陈伯华吕振华【摘要】　　目的观察凋亡相关基因FasLmRNA在椎间盘细胞中表达的分布。方法收集胎儿及成人病理腰椎间盘髓核标本，PHAP激活单个核细胞诱导FasL表达，提取总RNA，RTPCR制备FasL基因片段。定向克隆入质粒载体pSPT19多克隆位点构建重组质粒，体外转录制备DigFasLcRNA探针。cRNA探针原位杂交进行FasLmRNA表达分布的观察。结果克隆化FasL序列经DNA测序准确无误，体外转录cRNA探针标记效果满意；胎儿腰椎间盘组织脊索细胞、软骨样细胞中可检测到FasL

2、mRNA的较高杂交信号，成人突出椎间盘细胞中罕见正常细胞，未检出FasLmRNA信号。结论FasL基因在胎儿期腰椎间盘细胞内表达，细胞凋亡发生早。成年时期，细胞数急剧减少，代谢功能低下，无法检出凋亡基因表达。【关键词】基因FasLRNA互补椎间盘原位杂交　　［ABSTRACT］ObjectiveToobservethedistributionofFasLmRNAinintervertebraldisc.MethodsNucleusgelatinosusspecimensfetusandpathologicdisc.PBMCtheactived

3、PBMC.AfragmentofFasLgeneplifiedfromtotalRNAusingonestepRTPCR.PCRproductidpSPT19RNAbarintervertebraldiscspecimensusinginsituhybridization.ResultsTheinsertedFasLcDNAfragmentinpSPT19FasLRNAsignalsergedinbothnotochordcellsandchondrocytelikecellsinthenucleusoffetaldiscs.Conc

4、lusionTheFasLmRNAbarintervertebraldisccells,andapoptosisoccurredearly.Inadult,thequantityofintervertebraldisccellsreduced,themetabolismofthemdecreased,andtheexpressionofFasLmRNAcouldnotbedetected.　　［KEY109、EasyHyb、分子克隆所用试剂盒、工具酶及所用仪器设备由青岛大学医学院附属医院中心实验室提供。　　1.2标本　　　　收集胎龄＞5月的胎

5、儿及手术取出的椎间盘髓核标本10例，置无菌EP管中液氮速冻后-70℃保存。10例病人中,男6例,女4例;年龄32～65岁,中位年龄50岁;病程6月～5年，平均1.4年。L4,5者5例，L5S1者4例。　　1.3引物设计　　引物依FasLmRNA序列（NM_000639.1）设计，其上游、下游引物分别来自mRNA序列。PCR产物长334bp。上游引物的5′端修饰PstⅠ酶切序列，下游引物5′端构建EcoRⅠ酶切位点，CTC保护。引物由北京华美公司合成。上游引物:5′CTCCTGCAGGCCCTTCAATTACCCATATCCC3′，下游引

6、物:5′CTCGAATTCGAGTTCTGCCAGCTCCTTCTGT3′。　　1.4人FasL基因片段的克隆化　　1.4.1FasL基因的诱导表达及总RNA的制备人全血1mL，100g/L的EDTA抗凝;分离单个核细胞，加入50mmol/LPHAP37℃激活15min;然后37℃孵育1h，QIAampRNAbloodMinikit提取总RNA。　　1.4.2cDNA的合成按照QIAampRNABloodMinikit说明，在反应混合液中加入下列试剂：5×Buffer10μL；10mmol/LdNTP2.0μL；5×Q液10μL；上、

7、下游引物各0.6μmol/L；RTPCR酶复合物2.0μL；Rnasin30U；总RNA1μg（经70℃温育5min）,总体积50μL。反应条件：50℃预变性30min；然后95℃15min,94℃1min,52℃1min,72℃1min,共40个循环;最后72℃延伸10min。QIAquickGelExtractionkit进行胶上PCR产物回收。　　1.4.3PCR产物的克隆PCR产物和质粒载体pSPT19分别进行EcoRⅠ、PstⅠ双酶切，15℃下T4连接酶连接反应16h。转化感受态大肠杆菌JM109（CaCl2法制备），氨苄青霉素抗

8、菌及PCR快速筛选获阳性重组子。碱裂解法提取质粒，酚氯仿法抽提。　　1.4.4DNA测序委托北京华美公司测序。　　1.5体外转录制备cRNA探针　　EcoRⅠ酶切线