fasl mrna在椎间盘细胞中表达的分布论文

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1、FasLmRNA在椎间盘细胞中表达的分布论文司春祥陈伯华吕振华【摘要】目的观察凋亡相关基因FasLmRNA在椎间盘细胞中表达的分布。方法收集胎儿及成人病理腰椎间盘髓核标本，PHAP激活单个核细胞诱导FasL表达，提取总RNA，RTPCR制备FasL基因片段。定向克隆入质粒载体pSPT19多克隆位点构建重组质粒，体外转录制备DigFasLcRNA探针。cRNA探针原位杂交进行FasLmRNA表达分布的观察。结果克隆化FasL序列经DNA测序准确无误，体外转录cRNA探针标记效果满意；胎儿腰椎间盘组织脊索细胞、软骨样细胞

2、中可检测到FasLmRNA的较高杂交信号，成人突出椎间盘细胞中罕见正常细胞，未检出FasLmRNA信号。结论FasL基因在胎儿期腰椎间盘细胞内表达.freelRNAinintervertebraldisc.MethodsNucleusgelatinosusspecimensfetusandpathologicdisc.PBMCtheactivedPBMC.AfragmentofFasLgeneplifiedfromtotalRNAusingonestepRTPCR.PCRproductidpSPT19RNAbarint

3、ervertebraldiscspecimensusinginsituhybridization.ResultsTheinsertedFasLcDNAfragmentinpSPT19FasLRNAsignalsergedinbothnotochordcellsandchondrocytelikecellsinthenucleusoffetaldiscs.ConclusionTheFasLmRNAbarintervertebraldisccells,andapoptosisoccurredearly.Inadult,th

4、equantityofintervertebraldisccellsreduced,themetabolismofthemdecreased,andtheexpressionofFasLmRNAcouldnotbedetected.［KEY109、EasyHyb、分子克隆所用试剂盒、工具酶及所用仪器设备由青岛大学医学院附属医院中心实验室提供。1.2标本来源收集胎龄＞5月的胎儿及手术取出的椎间盘髓核标本10例，置无菌EP管中液氮速冻后-70℃保存。10例病人中,男6例,女4例;年龄32～65岁,中位年龄50岁;病程6月～5年

5、，平均1.4年。L4,5者5例，L5S1者4例。1.3引物设计引物依FasLmRNA序列（NM_000639.1）设计，其上游、下游引物分别来自mRNA序列。PCR产物长334bp。上游引物的5′端修饰PstⅠ酶切序列，下游引物5′端构建EcoRⅠ酶切位点，CTC保护。引物由北京华美公司合成。上游引物:5′CTCCTGCAGGCCCTTCAATTACCCATATCCC3′，下游引物:5′CTCGAATTCGAGTTCTGCCAGCTCCTTCTGT3′。1.4人FasL基因片段的克隆化1.4.1FasL基因的诱

6、导表达及总RNA的制备人全血1mL，100g/L的EDTA抗凝;分离单个核细胞，加入50mmol/LPHAP37℃激活15min;然后37℃孵育1h，QIAampRNAbloodMinikit提取总RNA。1.4.2cDNA的合成按照QIAampRNABloodMinikit说明，在反应混合液中加入下列试剂：5×Buffer10μL；10mmol/LdNTP2.0μL；5×Q液10μL；上、下游引物各0.6μmol/L；RTPCR酶复合物2.0μL；Rnasin30U；总RNA1μg（经70℃温育5min）,.free

7、lin；然后95℃15min,94℃1min,52℃1min,72℃1min,共40个循环;最后72℃延伸10min。QIAquickGelExtractionkit进行胶上PCR产物回收。1.4.3PCR产物的克隆PCR产物和质粒载体pSPT19分别进行EcoRⅠ、PstⅠ双酶切，15℃下T4连接酶连接反应16h。转化感受态大肠杆菌JM109（CaCl2法制备），氨苄青霉素抗菌及PCR快速筛选获阳性重组子。碱裂解法提取质粒，酚氯仿法抽提。1.4.4DNA测序委托北京华美公司测序。1.5体外转录制备cRNA探针EcoRⅠ酶

8、切线性化重组质粒pSPT19，纯化、定量，按试剂盒说明，RNA聚合酶T7体外转录制备DigFasLcRNA探针。1.6原位杂交1.6.1杂交前处理载玻片及盖玻片经APES防脱片剂处理。组织块经40g/L多聚甲醛PBS（pH7.4）前固定45min，入300g/L蔗糖PBS过夜。OCT包埋，冷冻切片